從人類基因組草圖到完全圖譜——論基因組重復(fù)片段研究

作者：李東衛(wèi)，張玉波

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，“嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)”廣東省實(shí)驗(yàn)室，深圳 518120）

2001年發(fā)表的人類基因組草圖并沒有包含全部的基因組序列，直到二十年后，科學(xué)家們才正式宣布完成了人類全序列基因組圖譜，這其中主要的技術(shù)障礙就是重復(fù)片段的測(cè)序工作。

重復(fù)片段（segmental duplications，SDs）是指廣泛存在于基因組中的大于1 kb且序列相似性超過90%以上的大片段。它們可以通過基因組重排及拷貝數(shù)變異產(chǎn)生新基因和驅(qū)動(dòng)進(jìn)化，其大量存在于子端粒中，并與哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制性衰老以及癌癥等重要生物學(xué)過程密切相關(guān)，一直以來備受科學(xué)家關(guān)注。但是其序列特點(diǎn)使得常規(guī)的測(cè)序技術(shù)難以完全準(zhǔn)確測(cè)出全部序列，是基因組組裝工作的一個(gè)難點(diǎn)。

人類基因組全圖譜的完成將重復(fù)片段在生物體進(jìn)化、延緩衰老、疾病治療等方面的研究提供基礎(chǔ)。本文將就重復(fù)片段的重要性，研究的技術(shù)難點(diǎn)，研究現(xiàn)狀以及未來展望等方面展開論述。

重復(fù)片段的重要性

重復(fù)片段是基因組中序列高度相同的大片段，具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性。它們占人類參考基因組（T2T-CHM13）中的7.0%，長度為218 Mbp[2 ]，在中心體及子端粒區(qū)域富集高達(dá)10倍。

中心體所包含的5個(gè)典型重復(fù)為：α衛(wèi)星，β衛(wèi)星，CER衛(wèi)星，γ衛(wèi)星，CAGGG重復(fù)，以及重復(fù)子4。子端粒所包含的典型重復(fù)為：端粒相關(guān)重復(fù)（TAR）以及傳統(tǒng)的（TTAGGG）n重復(fù)[4 ]。

重復(fù)片段可以介導(dǎo)染色體重排，使常染色體和異染色體之間通過同源重組產(chǎn)生鑲嵌類型的重復(fù)的染色質(zhì)[5 ]。在最近新鑒定的人類重復(fù)片段中，Mitchell R等預(yù)測(cè)了182個(gè)新的候選蛋白編碼基因，并使用T2T-CHM13基因組重構(gòu)了重復(fù)基因（TBC1D3，SRGAP2C，ARHGAP11B），這些基因在人額皮質(zhì)增生中具有重要作用，揭示了重復(fù)片段結(jié)構(gòu)在人和他們近親物種之間的巨大進(jìn)化差異[6 ]。大量的染色體子端粒區(qū)含有重復(fù)片段[8 ]。復(fù)制性衰老被認(rèn)為是一種抗癌機(jī)制，限制細(xì)胞增殖。長壽的有機(jī)體經(jīng)歷更多的細(xì)胞分裂，因此具有更高的產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。端粒酶能夠增加端粒的長度，促進(jìn)癌細(xì)胞不斷增殖，因此長壽動(dòng)物體細(xì)胞傾向于抑制端粒酶的活性，從而抑制腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[10 ]

研究難點(diǎn)：大片段長度、多拷貝數(shù)、序列高度相似 ?

重復(fù)片段的大的片段長度，多拷貝數(shù)以及序列的高度相似是長期以來其研究的難點(diǎn)。各種測(cè)序技術(shù)的發(fā)展致力于解決這個(gè)問題。

重復(fù)片段長度范圍是1到400 kb [12 ]。而且，標(biāo)準(zhǔn)的長讀段校正工具，例如MUMmer 或Minimap2不能夠有效的捕捉低相似的重復(fù)片段，也經(jīng)常將重復(fù)片段與其它調(diào)控元件混淆[14 ]，為重復(fù)片段的研究帶來機(jī)遇。尤其是PacBio的HiFi讀段，具有長讀段的同時(shí)還具有較高的準(zhǔn)確度。但是，很多重復(fù)片段的長度要比HiFi讀段的平均長度要長，因此很難完全準(zhǔn)確的進(jìn)行組裝[3 ]。染色體重排，尤其是染色質(zhì)斷裂常發(fā)生在高GC區(qū)域[16 ]。同時(shí)，在T2T-CHM13基因組基礎(chǔ)上，Mitchell R等首次進(jìn)行了全基因組重復(fù)片段的研究。與當(dāng)前人類參考基因組（GRCh38）鑒定的167 Mbp復(fù)制片段相比，鑒定了更多的（218 Mbp）非冗余重復(fù)片段（圖2 a, b）。新發(fā)現(xiàn)91%的重復(fù)片段能更好地代表人的拷貝數(shù)，通過與非人靈長類基因組相比，前所未有的揭示了人類和其它近親在重復(fù)片段結(jié)構(gòu)中的雜合性以及廣泛的進(jìn)化差異[17 ]。

圖2 T2T-CHM13中新鑒定的染色體內(nèi)（a）與染色間（b）的重復(fù)片段[1 ]。

利用重復(fù)片段解析衰老機(jī)制未來可期

新組裝的T2T-CHM13的拷貝數(shù)比GRCh38高9倍，因此它能更好的呈現(xiàn)人類拷貝數(shù)變異。通過鑒定新基因的拷貝數(shù)變異，可篩選相應(yīng)的藥物治療靶點(diǎn)。

例如，CHM13鑒定到LPA、MUC3A、FCGR2基因的拷貝數(shù)變異與疾病相關(guān)[1]。此外，對(duì)于尚具爭議的疾病標(biāo)志基因，例如乳腺癌中ESR1 基因[18]，可以通過CHM13對(duì)其進(jìn)行分子進(jìn)化分析，進(jìn)而鑒定其突變和擴(kuò)增，確定其在乳腺癌中的作用。

盡管端粒作為抗衰老靶標(biāo)已研究多年，但是端粒長短變化與復(fù)制性衰老的關(guān)系仍不清楚。細(xì)胞減數(shù)分裂過程中端粒變短的機(jī)制是什么？重復(fù)片段拷貝數(shù)變異與端粒變短有無相關(guān)性？很多研究已證明端粒酶具有延長端粒長度的作用，具體的機(jī)制是什么？這些問題因此前端粒不能被準(zhǔn)確測(cè)序而長期未解決。

現(xiàn)在，人類基因組完全圖譜已基本實(shí)現(xiàn)，相信這些謎團(tuán)會(huì)很快解開。未來可以根據(jù)人類年齡增長過程中端粒重復(fù)片段的拷貝數(shù)變異，解析其抗衰老的機(jī)制。通過人為干預(yù)其拷貝數(shù)，可能用于探索生命的極限。

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