為應對全球來自競爭對手、投資者和不斷膨脹的世界經(jīng)濟體量等巨大的全球性壓力，制藥行業(yè)正在積極努力尋求降低成本的方法和手段。為了使自己在市場上保持領(lǐng)先地位，各大公司不斷進行藥物儲備，即保持新化學實體（NCEs）持續(xù)不斷地進入市場和取得進展。從統(tǒng)計來看，這些公司的費用投資占比最大的便是用在研發(fā)部門（R&D）。然而,這一戰(zhàn)略已經(jīng)難以維繼。潛在的NCEs耗盡，候選藥物變得更加復雜，都令他們頭痛不已。簡化藥物研發(fā)的技術(shù)因此變得極為重要。

縮短藥品投入市場的時間和追求投資回報率最大化，是制藥行業(yè)的兩大重要目標。本文簡要介紹一種可被用于制藥行業(yè)的強大技術(shù)——分子排阻色譜(SEC)，這一技術(shù)正在被越來越多地用于天然聚合物、合成聚合物和蛋白質(zhì)的分離與表征。重組靶向蛋白的探索

?????? 新藥探索的目標仍然是鑒定新的具有穩(wěn)定物化結(jié)構(gòu)的化合物，要求其能夠與生物靶點相互作用，以產(chǎn)生更好的療效。偶然發(fā)現(xiàn)一種具有活性的藥物的幾率越來越小，盡管如此，制藥公司還必須專注于對NCEs的探索，這種探索就只能通過真正從分子水平上理解疾病和傳染行為的表現(xiàn)方式來實現(xiàn)。21世紀的靶向藥物研發(fā)熱潮由此興起。

分子靶點很豐富，其中多數(shù)是蛋白質(zhì)，特別是膜蛋白。一旦被識別和分離,有機小分子就被篩選出來測試靶向反應。理想情況下，有機小分子可能會增加蛋白質(zhì)的信號通路或激活蛋白質(zhì)的某種功能，從而阻止發(fā)病或者緩解癥狀。

不幸的是，小分子/蛋白質(zhì)的相互作用往往是特定的，非選擇性的小分子就會產(chǎn)生副作用，最初的候選藥物能夠直接達到治療預期希望渺茫。因此，需要一定數(shù)量的基因操作才能達到預期。設(shè)計和測試這些重組蛋白質(zhì)及其相互作用就成為了對現(xiàn)代分析方法的真正考驗。分子排阻色譜法（SEC）

在研究聚合物的科學家圈子里，SEC已經(jīng)是應用廣泛的成熟技術(shù)（他們更習慣于稱這種技術(shù)為GPC）。而對于藥物研發(fā)者而言，SEC還是一種未被廣泛采用的新技術(shù)，它提供了一種快速純化樣品，并測量樣品尺寸大小及多分散度的方法。在SEC實驗中，樣品溶液通過一組色譜柱（色譜柱由謹慎選擇孔隙大小的固定相組成），較大的分子無法滲透固定相中的較小孔隙，因此，會更快地從色譜柱中洗脫出來。就這樣，根據(jù)分子大小的不同，樣品就被分成若干部分。比如一份蛋白質(zhì)樣品，就會通過色譜柱將折疊的、錯誤折疊的、未折疊的蛋白質(zhì)片段分離出來。樣品被分離后，進入到檢測器。

傳統(tǒng)的SEC系統(tǒng)通常使用紫外檢測器（UV）或示差檢測器（RI），以此來測量樣品中不同成分的濃度，然后在系統(tǒng)校正的基礎(chǔ)上,提供相對的分子量（MW）信息。然而，這類配置的系統(tǒng)具有極大的局限性，并不能充分發(fā)揮SEC這種分析方法的全部性能。

隨著技術(shù)的進步，SEC分析方法有了長足的發(fā)展。目前最先進的SEC分析系統(tǒng)包含多種檢測器，如小角光散射檢測器（LALS）、紫外檢測器（UV）、示差折光檢測器（RI）和粘度計等，這些檢測器所得結(jié)果可以相互結(jié)合，從而在極短時間內(nèi)給出豐富的數(shù)據(jù)信息，如絕對分子量、分子尺寸，以及關(guān)于結(jié)構(gòu)和支化等等的信息，同時并不依賴于任何假設(shè)、校正或者數(shù)據(jù)擬合，大大簡化藥物研發(fā)的成本。

在傳統(tǒng)SEC設(shè)置中，色譜柱校正通常用普魯蘭多糖（水相）和聚苯乙烯（有機相）標準品來校準，用MW與洗脫體積的對應關(guān)系來確定每種新樣品的MW相對值。當結(jié)合光散射檢測器的時候，樣品從色譜柱中洗脫出來，高級SEC可以直接測量樣品的絕對分子量分布，無需依賴于洗脫體積。選擇LALS（小角光散射）檢測技術(shù)，還可以不依賴于數(shù)學模型直接得到準確結(jié)果。此外，配有光散射檢測器的SEC提供MW的絕對測量，省去了復雜的預校正，只需簡單運行一個窄分布標準品，就可以修正所有檢測器延遲、峰展寬所引起的偏差。

????? ??將粘度計包含在檢測器設(shè)置中，意味著可以直接測量特性粘度（η）和分子密度。利用這一信息，結(jié)合RI或UV檢測器提供的濃度測量值，以及絕對MW數(shù)值，便可以得到流體力學體積（Rh）的真實數(shù)值。UV檢測器提供了除RI檢測以外的另一個濃度測量，使測量共聚物和共軛蛋白的MW絕對值成為可能。

在藥物研發(fā)這類嚴格把控的行業(yè)，高級SEC系統(tǒng)的好處不言而喻，它可以提供直接的和豐富的測量數(shù)據(jù)。有能力解決與蛋白質(zhì)、聚合物和輔料相關(guān)的多種應用。下面是一些使用這類系統(tǒng)的應用實例。? 利用高級SEC純化蛋白

一些候選藥物是在大腸桿菌中重組蛋白得到的，這些蛋白質(zhì)通常含有DNA碎片，必須清除和丟棄。光散射檢測器可以用于分離和定量分析樣本中的碎片和聚集體。

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圖1：牛血清白蛋白樣品中聚集體分布圖

（使用帶有RALS的三重檢測器測量）

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以牛血清蛋白（BSA）為例，如圖1所示，用直角光散射檢測器（RALS）(圖中綠色曲線)測量散射光，其對聚合分子測量的靈敏度遠高于RI（圖中紅色曲線）或UV（圖中紫色曲線）。大量研究已經(jīng)明確，BSA單體大約在保留體積（橫坐標）14.00 mL處，二聚體約在11.80 mL處，三聚體在略多于11 mL處，更大的蛋白質(zhì)聚合物大約在保留體積8mL處，還有一個未知的低聚物拖尾。在分析8mL處的蛋白質(zhì)聚集體時，UV和RI兩個濃度檢測器幾乎沒有信號，RALS檢測器則清楚地顯示了在這段保留時間處存在兩個不同的峰。這是因為光散射強度是MW和濃度的雙重函數(shù)，而不只與濃度相關(guān)。利用高級SEC定量蛋白質(zhì)寡聚體

帶有多重檢測器的SEC還提供了一個收集純化樣品的定量數(shù)據(jù)的絕佳方法。從蛋白質(zhì)研究角度看，這使得評估寡聚化成為可能。

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圖2 人血清蛋白（HSA）色譜圖

（使用三重檢測器測量）

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圖2是一個人血清蛋白（HSA）分離樣品RI濃度（圖中紅色曲線）和MW（圖中黑色曲線）與保留體積關(guān)系的圖。這些結(jié)果產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)如表1所示，展示了此方法的簡潔。舉個例子，單體的MW可以直接從表中讀出，即66550道爾頓。

由于每個寡聚體的MW是可以獲得的，因而所有四個峰值的重量分數(shù)(Wt Fr)也可以算出。表1顯示該樣品由94.5%的單體、5.1%的二聚體、0.4%的三聚體和0.1%的四聚體組成。這是一個用帶有三重檢測器的SEC獲得深度定量信息的范例。即使初始濃度低至0.1%，光散射測量仍然可以得到準確的MW，如表1中四聚體峰的結(jié)果。

表1人血清蛋白（HSA）數(shù)據(jù)表

（使用帶三重檢測器的SEC測量）蛋白質(zhì)/緩沖液匹配性的研究

所有的NCEs都需要測試其在不同緩沖條件下的穩(wěn)定性。當鹽種類和濃度不同時，一些蛋白質(zhì)片段可能已經(jīng)從根本上改變了構(gòu)象。所以建立一個緩沖溶液體系來模擬樣品原始條件至關(guān)重要。圖3所示的例子顯示，鈣離子存在的體系中，一個多肽片段發(fā)生伸展。?

圖3洗脫液中是否含有鈣離子對結(jié)構(gòu)域的影響

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這種重復序列毒素的多肽結(jié)構(gòu)域（RD）的構(gòu)象，與鈣離子有關(guān)。在這個實驗中，同一種RD使用兩種不同的流動相進樣，濃度使用UV測量。第一種洗脫液中有鈣離子，而第二種則沒有。如圖3所示，峰值從14 mL減小到大約10.5 mL。這表明RD發(fā)生了構(gòu)象變化或者色譜柱中存在靜電相互作用。

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圖4 RALS信號[紅色曲線]和粘度計[藍色曲線]的信號

至apo-RD[虛線]或holo-RD[平滑線]區(qū)分蛋白質(zhì)構(gòu)象變化

在上面的例子中，盡管我們已經(jīng)知道了變化，并理解了產(chǎn)生這一變化的可能原因，但傳統(tǒng)的基于蛋白保留體積的SEC并不能對靜電相互作用或構(gòu)象改變做進一步區(qū)分。圖4所示的結(jié)果表明，結(jié)合了RALS和粘度計的高級SEC清楚地顯示了RD的apo-(未折疊的)和holo-(穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu))狀態(tài)是單分子結(jié)構(gòu)。

表2顯示了這個例子中apo-RD的特性粘度較高（0.35 dL/g），說明RD可能在缺鈣時采取水合物和/或展開的構(gòu)象。結(jié)合RALS數(shù)據(jù)，可以計算出絕對分子量。

表2 利用RALS、RI和粘度計測量的數(shù)據(jù)結(jié)果

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數(shù)據(jù)結(jié)果表明，盡管它們的粘度不同，但是具有相同的絕對分子量，這證實了它們是單體。流體力學體積大小的差異暗示RD發(fā)生了解折疊。 結(jié)論

現(xiàn)在，想要在醫(yī)藥開發(fā)市場中生存并且壯大，需要高效的分析技術(shù)作為支撐。日漸興起的高級SEC技術(shù)提供了驗證和優(yōu)化NCEs的新手段。隨著研究中化學物質(zhì)越來越復雜，對結(jié)果精確度的要求就會越來越高，依賴于假設(shè)或數(shù)學擬合算法得到的結(jié)果將逐步被直接測量所替代。配有多重檢測器的SEC系統(tǒng)可以在相同的測試過程中收集更多的信息，它將有效縮短新藥研發(fā)時間，有助于制藥企業(yè)提升市場競爭力。