NgAgo 又搞事情了。

　　11月11日，Nature 旗下生命科學(xué)期刊 Cell Reseach 在線刊登了中國南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室副教授劉東團(tuán)隊關(guān)于 NgAgo 研究的最新成果——他們發(fā)現(xiàn) NgAgo 系統(tǒng)確實有效!在這篇題為 NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish 的 Letter to the editor 中，研究者觀察到，NgAgo 確實可以改變斑馬魚的表型，但這并非是通過基因編輯實現(xiàn)的。事實上，團(tuán)隊通過實驗得出結(jié)論，NgAgo 系統(tǒng)可以在不改變目標(biāo)基因序列的情況下，對基因表達(dá)實現(xiàn) knockdown(即下調(diào)其目標(biāo) mRNA 表達(dá)水平)，且這可能與 NgAgo 的基因剪切活性沒有關(guān)系。

　　文章作者同時強(qiáng)調(diào)，他們沒有在斑馬魚中觀察到 NgAgo 系統(tǒng)的基因編輯功能。

　　所以，曾經(jīng)的“基因編輯工具”

　　真正作用是 knockdown ?!

　　我們這里先簡單介紹一下以上的幾個結(jié)論是怎么做出來的。

　　首先，NgAgo 可以改變斑馬魚的表型，但與基因編輯無關(guān)

　　研究者選擇了斑馬魚中一個名叫 fabp11a 的基因作為 NgAgo 的“調(diào)控”對象。這個基因可以編碼一種脂肪酸結(jié)合蛋白，可以調(diào)節(jié)葡萄糖及脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，還有炎癥反應(yīng)。除了試試 NgAgo，研究者還想看看 fabp11a 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程的作用，于是，他們將編碼 NgAgo 的 mRNA 和設(shè)計好的 5’-磷酸化單鏈 DNA 一起注射到了單細(xì)胞時期的斑馬魚胚胎中。

　　為了確保注射的 NgAgo mRNA 能夠進(jìn)入細(xì)胞核表達(dá) NgAgo 蛋白，研究者專門在 mRNA 的兩端增加了細(xì)胞核的定位序列(NLS);而 5’-磷酸化單鏈 DNA 專門靶向 fabp11a 的第二和第三個外顯子——如果 NgAgo 能編輯基因，這兩段基因序列將會被改變。

是：NgAgo 的存在，使 30% 的斑馬魚胚胎在發(fā)育后出現(xiàn)了眼部畸形，但這不是基因編輯的結(jié)果(*3)!

　　測序發(fā)現(xiàn)，fabp11a 的基因沒有發(fā)生任何變化，反倒是 fabp11a mRNA 的相對表達(dá)量下降了約50%。

　　fabp11a 沒有被編輯，但被 knockdown 了。

　　其次，NgAgo 的 knockdown 作用在斑馬魚中存在普遍性。

　　NgAgo 對 fabp11a mRNA 表達(dá)的下調(diào)是一個意外嗎?為了驗證這一點，研究人員又對斑馬魚中的其他四個基因進(jìn)行的測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靶向 ta、kdrl、 lama1 和 flt1 這4個基因時，NgAgo 都能實現(xiàn) knockdown 作用，并且改變基因所對應(yīng)的表型。

　　NgAgo 的 knockdown 作用是具有普遍性的。

　　最后，作者沒有在 NgAgo 中重復(fù)出基因編輯功能

　　河北科技大學(xué)教授韓春雨此前在《自然-生物技術(shù)》上發(fā)表的文章顯示，NgAgo 系統(tǒng)可以在 37°C 的條件下對人細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，編輯效率為 11.2%-41.3%。研究者在確保半數(shù)以上的實驗斑馬魚胚胎能正常發(fā)育的條件下，將實驗溫度設(shè)定為 37°C。然而結(jié)果顯示，NgAgo 系統(tǒng)在這一條件下仍沒有表現(xiàn)出任何基因編輯活性——盡管 knockdown 效應(yīng)仍然存在。

　　有趣的是，當(dāng)研究者將 NgAgo 中兩個天冬氨酸位點進(jìn)行突變 —— 有研究預(yù)測，這兩個位點與 NgAgo 的基因剪切催化活性有關(guān)，并沒有對實驗中出現(xiàn)的 knockdown 效應(yīng)產(chǎn)生影響。 這說明，研究者觀察到的 knockdown 效應(yīng)可能與NgAgo 的基因剪切活性沒有關(guān)系。

　　最后，研究者以這樣一句話結(jié)束了本篇文章：

　　??we hypothesize that gDNA/NgAgo may bind to a target gene to block its transcription. Overall, we suggest that the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene knockdown in zebrafish.

　　我們提出一種假設(shè)，即 gDNA/NgAgo 的作用可能是結(jié)合目標(biāo)基因，從而阻礙基因的轉(zhuǎn)錄。總的說來，我們認(rèn)為 gDNA/NgAgo 為斑馬魚中的基因knockdown 提供了一種替代方案。

　　為斑馬魚中的基因 knockdown 提供了一種替代方案。

　　為基因 knockdown 提供了一種替代方案。