伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

中英文名稱

規(guī)格

價格

說明書

Issyk-Kul Virus

伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

50次

3990元

運輸：低溫

保存：負20度

有效期：一年

貨期：2-3周

產(chǎn)品及特點

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠50次20 L反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

規(guī)格及成分

成分

編號

十孔盒包裝

2 qPCR MagicMix

試劑一

500 L（棕色管）

熒光PCR專用模板稀釋液

試劑二

1 mL（黃蓋）

伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR引物混合物

試劑三

100 L（白蓋）

伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR陽性對照

(1 10E8 拷貝/ L)

試劑四

50 L（紅蓋）

使用手冊

試劑五

1份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。

自備試劑 

DNA模板、10 ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

使用方法

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/ L這6個10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 L熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 L 1 10E8拷貝/ L 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1 10E7拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 L 1 10E7拷貝/ L 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1 10E6拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 L 1 10E6拷貝/ L的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1 10E5拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 L上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1 10E4 拷貝/ L，10 L相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1 10E5 拷貝/ L，10 L相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200 L樣品，則PC和NC的體積也必須是200 L。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 L體系，在樣品制備室進行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：

成分

樣品管

N+2個

PCR陰性對照管

PCR陽性

對照管（2-7管）

2 qPCR MagicMix

（棕色管）

10  L

10  L

各10  L

伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR

引物混合液（白蓋）

2  L

2  L

各2  L

自備10 ROX (見注)

2 L

2 L

各2 L

 N+2待測樣品DNA模板

6  L

不加

不加

第7步所得PCR陽性對照

稀釋液（2-7號）

不加

不加

各6 L（2號樣到2號管，3號樣到3號管 ）

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過程

溫度

時間

預(yù)變性

92℃

5分鐘

PCR反應(yīng)

（30個循環(huán)）

92℃

60 秒

54℃

60 秒

72℃

60 秒

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。 

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

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