伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
中英文名稱
規(guī)格
價格
說明書
Issyk-Kul Virus
伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
50次
3990元
運輸:低溫
保存:負20度
有效期:一年
貨期:2-3周
產(chǎn)品及特點
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-保守序列設(shè)計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測,避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20 L反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分
成分
編號
十孔盒包裝
2 qPCR MagicMix
試劑一
500 L(棕色管)
熒光PCR專用模板稀釋液
試劑二
1 mL(黃蓋)
伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR引物混合物
試劑三
100 L(白蓋)
伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR陽性對照
(1 10E8 拷貝/ L)
試劑四
50 L(紅蓋)
使用手冊
試劑五
1份
運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存,保存期限一年。
自備試劑
DNA模板、10 ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。
使用方法
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/ L這6個10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標(biāo)準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 L熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 L 1 10E8拷貝/ L 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1 10E7拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 L 1 10E7拷貝/ L 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1 10E6拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 L 1 10E6拷貝/ L的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1 10E5拷貝/ L的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?0 L上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1 10E4 拷貝/ L,10 L相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(濃度為1 10E5 拷貝/ L,10 L相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200 L樣品,則PC和NC的體積也必須是200 L。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 L體系,在樣品制備室進行)
10. 如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加):
成分
樣品管
N+2個
PCR陰性對照管
PCR陽性
對照管(2-7管)
2 qPCR MagicMix
(棕色管)
10 L
10 L
各10 L
伊塞克湖病毒探針法熒光定量RT-PCR
引物混合液(白蓋)
2 L
2 L
各2 L
自備10 ROX (見注)
2 L
2 L
各2 L
N+2待測樣品DNA模板
6 L
不加
不加
第7步所得PCR陽性對照
稀釋液(2-7號)
不加
不加
各6 L(2號樣到2號管,3號樣到3號管 )
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照,其他熒光PCR儀器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
過程
溫度
時間
預(yù)變性
92℃
5分鐘
PCR反應(yīng)
(30個循環(huán))
92℃
60 秒
54℃
60 秒
72℃
60 秒
13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時,大吸收光譜在471 nm,結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm,大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
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