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檢查病原體檢查新方法和操作步驟

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2021-03-30  來(lái)源:儀器網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):63
核心提示:產(chǎn)品采集與樣品處理于同一批 號(hào)的 二個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取 12個(gè)蕞小銷售包裝樣品,1/4樣品用于檢測(cè),1/4樣品用于留樣,另 1/2樣品(可就地封存)必要時(shí)用于復(fù)檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應(yīng)有破裂,檢驗(yàn)前不得啟開。在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方

產(chǎn)品采集與樣品處理

于同一批 號(hào)的 二個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取 12個(gè)蕞小銷售包裝樣品,1/4樣品用于檢測(cè),1/4樣品用于留樣,另 1/2樣品(可就地封存)必要時(shí)用于復(fù)檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應(yīng)有破裂,檢驗(yàn)前不得啟開。

在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方法打開用于檢測(cè)的至少 3個(gè)包裝,從每個(gè)包裝中取樣,準(zhǔn)確稱取10g 1g樣品。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中,充分混勻,得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí),稀釋液量可按每次 50ml遞增,直至能吸出足夠測(cè)試用樣液。在計(jì)算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時(shí)相應(yīng)調(diào)整稀釋度。

B2  細(xì)菌菌落總數(shù)與初始污染菌檢測(cè)方法

本方法適用于產(chǎn)品初始污染菌與細(xì)菌菌落總數(shù)(以下統(tǒng)稱為細(xì)菌菌落總數(shù))檢測(cè)。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計(jì)數(shù)。共接種 5個(gè)平皿,每個(gè)平皿中加人 1ml樣液,然后用冷卻至45℃左右的熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 15~20ml倒人每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻 。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 35℃ 2℃培養(yǎng) 48h后,計(jì)算平板上的菌落數(shù)。

B2.2 結(jié)果報(bào)告

菌落呈片狀生長(zhǎng)的平板不宜采用;計(jì)數(shù)符合要求的平板上的菌落,按式(B1)計(jì)算結(jié)果:

X1=A (K 5)

式中X1 細(xì)菌菌落總數(shù) cfu/g或cfu/mL;

A 5塊營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌菌落總數(shù);

K 稀釋度。

當(dāng)菌落數(shù)在 100以內(nèi),按實(shí)有數(shù)報(bào)告,大于 100時(shí)采用二位有效數(shù)字。

如果樣品菌落總數(shù)超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,按 B2.3進(jìn)行復(fù)檢和結(jié)果報(bào)告。

B2.3 復(fù)檢方法

將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測(cè) 2次,2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結(jié)果平均值超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,則判定被檢樣品不合格。

B3  大腸菌群檢測(cè)方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種 50ml,乳糖膽鹽發(fā)酵管,置 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,則報(bào)告為大腸菌群陰性。

如產(chǎn)酸產(chǎn)氣,則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板,置35℃ 2℃培養(yǎng) 18~24h,觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤(rùn),常具有金屬光澤,也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紅色,中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢,同時(shí)接種乳糖發(fā)醉管,置 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,觀察產(chǎn)氣情況。

B3.2 結(jié)果報(bào)告

凡乳糖膽鹽發(fā)酵骨產(chǎn)酸產(chǎn)氣,乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣,在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落,革蘭氏染色為陰性無(wú)芽胞桿菌,可報(bào)告被檢樣品檢出大腸桿菌。

B4  綠膿桿菌檢測(cè)方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml,加人到50ml SCDLP培養(yǎng)液中,充分混勻,置 35℃ 2℃培養(yǎng) 18~24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng),培養(yǎng)液農(nóng)面呈現(xiàn)一層薄菌膜,培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物,劃線接種十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板,置 35℃ 2℃ 培養(yǎng) 18~24h,觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色,其他菌不長(zhǎng)。

取可疑菌落涂片作革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn):

氧化酶試驗(yàn):取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),用無(wú)菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上,然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基對(duì)苯二胺試液,30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色,為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗(yàn):取2-3個(gè)可疑菌落,分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面,35℃ 2℃培養(yǎng)24h,加入 3~5ml,充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解,待三-氯-甲-烷呈藍(lán)色時(shí),用吸管移到另一試管中并加人 1mol/L的鹽酸1mL,振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽(yáng)性,表示有綠膿菌素存在。

硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn):挑取被檢菌落純培養(yǎng)物接種在硝酸鹽脈水培養(yǎng)基中,置 35C12C培養(yǎng)24h培養(yǎng)基小倒管中有氣者即為陽(yáng)性

明膠液化試驗(yàn):取可疑菌落純培養(yǎng)物,穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi),置 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,取出放于4~10C,如仍呈液態(tài)為陽(yáng)性,凝固者為陰性。

42℃生長(zhǎng)試驗(yàn):取可疑培養(yǎng)物,接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上,置 42℃培養(yǎng) 24~48h,有綠膿桿菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性。

B4.2 結(jié)果報(bào)告

被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后,證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶及綠膿桿菌試驗(yàn)均為陽(yáng)性者,即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌 如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí),仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。

B5 金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法

B5.1 操作步驟

取樣液 5ml,加入到 50mL SCDLP培養(yǎng)液中,充分混勻,置 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,自上述增菌液中取1~2接種環(huán),劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上,置 35℃ 2℃培養(yǎng)24~48h。在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,周圍有溶血圈。

挑取典型菌落,涂片作革蘭氏染色鏡檢,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌,排列成葡萄狀,無(wú)芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述情況,應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn):

甘露醇發(fā)酵試驗(yàn):取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液,置 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽(yáng)性。

血漿凝固酶試驗(yàn):(1)玻片法:取清潔干燥載玻片,一端滴加一滴生理鹽水,另一端滴加一滴兔血漿,挑:取菌落分別與生理鹽水和血漿混合,5min如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊,而鹽水滴仍呈均勻混濁無(wú)凝固則為陽(yáng)性,如兩者均無(wú)凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象,再進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn);(2)試管法:吸取 1:4新鮮血漿 0.5ml,放滅菌小試管中,加入等量待檢菌 24hrou湯培養(yǎng)物 0.55mL,混勻,放 35℃ 2℃溫箱或水浴中,每半小時(shí)觀察一次,24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株湯培養(yǎng)物各0.5ml,作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照。

B5.2 結(jié)果報(bào)告

凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長(zhǎng),鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌,并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸,血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者,可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

B6 溶血性鏈球菌檢測(cè)方法

B6.1 操作步驟

取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖ROU湯, 35℃ 2℃培養(yǎng) 24h,將培養(yǎng)物劃線接種血瓊脂平板, 35℃ 2℃培養(yǎng)24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰自色,半透明或不透明,針尖狀突起,表面光滑,邊緣整齊,周圍有無(wú)色透明溶血圈。

挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢,應(yīng)為革蘭氏陽(yáng)性,呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況,應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn):

鏈激酶試驗(yàn):吸取草酸鉀血漿 0.2ml(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻,經(jīng)離心沉淀,吸取上清液),加人 0.8ml滅菌生理鹽水,混勻后再加人待檢菌 24h rou湯培養(yǎng)物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml,混勻,放 35℃ 2℃水浴中,2min觀察一次(一般10min內(nèi)可凝固),待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時(shí)間。如 2h內(nèi)不溶化,繼續(xù)放置 24h觀察,如凝塊全部溶化為陽(yáng)性,24h仍不溶化為陰性。

桿菌膚敏感試驗(yàn):將被檢菌菌液涂于血平板上,用滅菌鑷子取每片含 0.04單位桿菌膚的紙片放在平板表面仁,同時(shí)以已知陽(yáng)性菌株作對(duì)照,在 35℃ 2℃下放置 18~24h,有抑菌帶者為陽(yáng)性。

B6.2 結(jié)果報(bào)告

鏡檢革蘭氏陽(yáng)性鏈狀排列球菌,血平板上呈現(xiàn)溶血圈,鏈激酶和桿菌膚試驗(yàn)陽(yáng)性,可報(bào)告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總數(shù)檢測(cè)方法

B7.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作真菌計(jì)數(shù)。共接種5個(gè)平皿,每個(gè)平皿中加人 1ml樣液,然后用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基 15 ~25mL倒人每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻,瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 25℃ 2℃培養(yǎng) 7天,分別于 3,5,7天觀察,計(jì)算平板上的菌落數(shù),如果發(fā)現(xiàn)菌落蔓延,以前 一次的菌落計(jì)數(shù)為準(zhǔn)。

B7.2 結(jié)果報(bào)告

菌落呈片狀生長(zhǎng)的平板不宜采用;計(jì)數(shù)符合要求的平板上的菌落,按式(B2)計(jì)算結(jié)果:

X2=B (K 5)

式中X2 真菌菌落總數(shù),cfu/g或cfu/mL;

B 5塊沙氏瓊脂培養(yǎng)基平板上的真菌菌落總數(shù);

K 稀釋度。

當(dāng)菌落數(shù)在 100以內(nèi),按實(shí)有數(shù)報(bào)告,大于 100時(shí)采用二位有效數(shù)字。

如果樣品菌落總數(shù)超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,按 B7.3進(jìn)行復(fù)檢和結(jié)果報(bào)告。

B7.3 復(fù)檢方法

將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測(cè) 2次,2次結(jié)果都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結(jié)果超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,則判定被檢樣品不合格。

B8 真菌定性檢測(cè)方法

B8.1 操作步驟

取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養(yǎng)基中, 25℃ 2℃培養(yǎng) 7天,逐日觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)。 

B8.2 結(jié)果報(bào)告

培養(yǎng)管混濁應(yīng)轉(zhuǎn)種沙氏瓊脂培養(yǎng)基,證實(shí)有真菌生長(zhǎng),可報(bào)告被檢樣品檢出真菌。

 
 
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