質(zhì)粒測序發(fā)現(xiàn)基因出現(xiàn)突變，對后續(xù)基因表達有影響嗎？

意料之外的同義突變，雖不改變蛋白質(zhì)氨基酸的序列，但可能出乎意料的賦予蛋白質(zhì)別樣的 人生 。

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基因的同義突變

由于密碼子的簡并性，基因的同義突變不改變原有密碼子所編碼的氨基酸，因此，蛋白質(zhì)的氨基酸序列保持不變。

好像我們一直以來，都去了解蛋白的氨基酸的序列是否改變，卻沒有想過：同義突變后的蛋白，雖然氨基酸序列未發(fā)生改變，但其表達水平是真的沒有變化嗎？

于是我們準(zhǔn)備了這篇文章，希望能讓大家更好地了解這一現(xiàn)象。

同義突變帶來的蛋白表達變化

先看一個同義突變后的小鼠c-Fos蛋白外源性表達的情況。大致是這樣子的：c-Fos蛋白在大腸桿菌中外源性不表達。因此，構(gòu)建兩個同義突變的c-Fos基因M1和M2的表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達后，分別檢測表達量變化。

圖1【1】A. 同義密碼子改造。M1:140位氨基酸至146位氨基酸中的精氨酸使用zui優(yōu)化的密碼子的c-Fos蛋白。M2：119位氨基酸至159位氨基酸中的精氨酸使用zui優(yōu)化的密碼子的c-Fos蛋白。B.IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達，3h后Western Blot測定表達量。1：未經(jīng)突變的c-Fos蛋白；2：M1；3：M2；4：c-Fos純化蛋白。

聰明的你，一定會發(fā)現(xiàn)：相較于未發(fā)生突變的c-Fos蛋白，同義突變后的M1蛋白表達量無變化，M2蛋白表達量增加。因此，同義突變對于蛋白而言，除了氨基酸序列不變外，正如你我明日的生活，前路漫漫，不可預(yù)測，驚喜連連。

同義突變影響蛋白表達的原因

與你一樣，我也對什么樣的同義突變會引起蛋白表達量變化產(chǎn)生了疑問？

簡并性的密碼子也被稱為同義密碼子。在基因組中，同義密碼子的使用頻率存在差異，這種現(xiàn)象被稱為密碼子使用偏好性。那些使用頻率高的密碼子，我們叫做偏愛密碼子；剩余的則為稀有密碼子。那么，那些被偏愛的密碼子是否有恃無恐地協(xié)助蛋白表達呢，下面列舉幾種同義密碼子影響蛋白表達水平的機制。

一、翻譯選擇機制

認(rèn)為翻譯速率和翻譯準(zhǔn)確性的自然選擇導(dǎo)致優(yōu)先選擇偏愛密碼子。

1.偏愛密碼子具有更高的翻譯延伸速度，可節(jié)約蛋白的翻譯時間，同時節(jié)省細(xì)胞內(nèi)有限的核糖體資源。此外，較高的延伸速度可提升細(xì)胞翻譯起始過程的進行，有利于細(xì)胞所有基因的表達。

2.對那些偏愛密碼子，正確的氨基酸會很快被連接上；但對稀有密碼子，要經(jīng)過多次相互辨認(rèn)才能找到正確的氨基酸，這樣蛋白合成受阻。當(dāng)稀有密碼子較多時，會發(fā)生明顯停頓，抑制蛋白合成。同時，非對應(yīng)氨基酸錯誤摻入率增加，蛋白翻譯出錯率增高，合成的蛋白對于細(xì)胞而言，是浪費甚至是有毒性的。

圖2 Degenerate codons do not necessarily lead to equally efficient expression of an amino acid.

二、同義突變也會影響mRNA水平

除了翻譯過程中，對于密碼子偏好性的選擇外，密碼子使用偏好對mRNA水平的調(diào)控作用也是影響蛋白表達水平的因素。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所錢文峰研究組揭示同義密碼子對于mRNA水平的調(diào)控于今年8月底發(fā)表于Molecular Biology and Evolution。課題組在酵母中合成了GFP的同義密碼子突變體，發(fā)現(xiàn)同義密碼子的使用可以調(diào)控mRNA水平，同義突變后，偏愛密碼子使用率高的同義突變體，其mRNA的水平高。

圖3 同義密碼子調(diào)控mRNA水平，并且該調(diào)控可能通過影響mRNA降解速率而實現(xiàn)。CAI：密碼子適應(yīng)指數(shù)。同義突變中，偏愛密碼子越多，CAI值越大。Log2(mRNA)：mRNA的豐度。

mRNA的表達水平是由其產(chǎn)生和降解的平衡所決定的，為了證明調(diào)控可能是通過影響mRNA的穩(wěn)定性（即影響降解過程）實現(xiàn)的，在使用轉(zhuǎn)錄抑制劑硫藤黃素thiolutin后，檢測不同時間點的同義突變體的mRNA水平。發(fā)現(xiàn)偏愛密碼子的同義突變體的mRNA更穩(wěn)定。文章進一步解釋了密碼子使用偏好與鄰近序列也有關(guān)系。

如何優(yōu)化或避免同義突變？

由實驗需求的不同，可能需要出現(xiàn)同義突變或避免出現(xiàn)同義突變。對于需要通過密碼子優(yōu)化改變蛋白表達量的實驗（如蛋白純化等），提供一篇關(guān)于密碼子優(yōu)化的參考文章：Codon bias and heterologous protein expression（Trends in Biotechnology）。

而對于擔(dān)心同義突變造成蛋白表達變化的實驗，構(gòu)建載體時，克隆基因使用高保真度、突變率低的DNA聚合酶至關(guān)重要！

參考文獻

1. Deng T. Bacterial expression and purification of biologically active mouse c-Fos proteins by selective codon optimization. FEBS Lett. 1997 Jun 9;409(2):269-72.

2. Zhou T, Weems M, Wilke CO. Translationally optimal codons associate with structurally sensitive sites in proteins. Mol Biol Evol. 2009 Jul;26(7):1571-80.

3. Yu CH, Dang Y, Zhou Z. Codon Usage Influences the Local Rate of Translation Elongation to Regulate Co-translational Protein Folding. Mol Cell. 2015 Sep 3;59(5):744-54.

4. Zhou Z, Dang Y. Codon usage is an important determinant of gene expression levels largely through its effects on transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Oct 11;113(41):E6117-E6125.

5. Chen S1, Li K, Cao W. Codon-Resolution Analysis Reveals a Direct and Context-Dependent Impact of Individual Synonymous Mutations on mRNA Level. Mol Biol Evol. 2017 Nov 1;34(11):2944-2958.

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