在細(xì)胞生命過程中,會(huì)把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯,轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。這一過程我們稱之為基因表達(dá)。也就是說,基因表達(dá)成功的標(biāo)志是合成出了蛋白質(zhì)。生物體生命活動(dòng)中并不是所有的基因都同時(shí)表達(dá),代謝過程中所需要的各種酶和蛋白質(zhì)的基因以及構(gòu)成細(xì)胞化學(xué)成分的各種編碼基因,正常情況下是經(jīng)常表達(dá)的,而與生物發(fā)育過程有關(guān)的基因則要在特定的時(shí)空才表達(dá)。
1、轉(zhuǎn)錄過程
在RNA聚合酶的催化下,以DNA為模板合成mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄(transcription)。在雙鏈DNA中,作為轉(zhuǎn)錄模板的鏈稱為模板鏈(template strand)或反義鏈(antisense strand);而不作為轉(zhuǎn)錄模板的鏈稱為編碼鏈(coding strand)或有義鏈(sense strand),編碼鏈與模板鏈互補(bǔ),它與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異僅在于DNA中的胸腺嘧啶(T)變?yōu)镽NA中的尿嘧啶(U)。
在含許多基因的DNA雙鏈中,每個(gè)基因的模板鏈并不總是在同一條鏈上,亦即可作為某些基因模板鏈的一條鏈,同時(shí)也可以是另外一些基因的編碼鏈。
轉(zhuǎn)錄后要進(jìn)行加工,轉(zhuǎn)錄后的加工包括:
剪接
一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄在一條原始轉(zhuǎn)錄物RNA分子中,稱為前mRNA(pre-mRNA),又稱核內(nèi)異質(zhì)RNA(heterogenous nuclear RNA,hnRNA)。
因此前mRNA分子既有外顯子序列又有內(nèi)含子序列,另外還包括編碼區(qū)前面及后面非翻譯序列。這些內(nèi)含子序列必須除去而把外顯子序列連接起來,才能產(chǎn)生成熟的有功能的mRNA分子,這個(gè)過程稱為RNA剪接(RNA splicing)。剪切發(fā)生在外顯子的3’末端的GT和內(nèi)含子3’末端與下一個(gè)外顯子交界的AG處。
加帽
幾乎全部的真核 mRNA 端都具“帽子”結(jié)構(gòu)。雖然真核生物的mRNA的轉(zhuǎn)錄以嘌呤核苷酸三磷酸(pppAG或pppG)領(lǐng)頭,但在5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸(m7GpppAGpNp)。mRNA 5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子(cap)。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。
mRNA的帽結(jié)構(gòu)功能:①能被核糖體小亞基識(shí)別,促使mRNA和核糖體的結(jié)合;②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉RNA 5’末端,以保護(hù)mRNA免疫5’核酸外切酶的降解,增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。
加尾
大多數(shù)真核生物的mRNA 3’末端都有由100~200個(gè)A組成的Poly(A)尾巴。Poly(A)尾不是由DNA編碼的,而是轉(zhuǎn)錄后的前mRNA以ATP為前體,由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶,即Poly(A)聚合酶催化聚合到3’末端。加尾并非加在轉(zhuǎn)錄終止的3’末端,而是在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’末端,由一個(gè)特異性酶識(shí)別切點(diǎn)上游方向13~20堿基的加尾識(shí)別信號(hào)AAUAAA以及切點(diǎn)下游的保守順序GUGUGUG,把切點(diǎn)下游的一段切除,然后再由Poly(A)聚合酶催化,加上Poly(A)尾巴,如果這一識(shí)別信號(hào)發(fā)生突變,則切除作用和多聚腺苷酸化作用均顯著降低。mRNA Poly(A)尾的功能是:①可能有助mRNA從核到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);②避免在細(xì)胞中受到核酶降解,增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。
2、翻譯過程
稱為翻譯是以mRNA作為模板,tRNA作為運(yùn)載工具,在有關(guān)酶、輔助因子和能量的作用下將活化的氨基酸在核糖體(亦稱核蛋白體)上裝配為蛋白質(zhì)多肽鏈的過程,轉(zhuǎn)錄過程大致可分為3個(gè)階段:
1)肽鏈起始
在許多起始因子的作用下,首先是核糖體的小亞基和mRNA上的起始密碼子結(jié)合,然后甲酰甲硫氨酰tRNA(tRNA fMet)結(jié)合上去,構(gòu)成起始復(fù)合物。通過tRNA的反密碼子UAC,識(shí)別mRNA上的起始密碼子AUG,并相互配對(duì),隨后核糖體大亞基結(jié)合到小亞基上去,形成穩(wěn)定的復(fù)合體,從而完成了起始的作用。
2)鏈延長(zhǎng)
核糖體上有兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)——P位和A位,可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)氨酰tRNA。當(dāng)核糖體沿著mRNA從5’→3’移動(dòng)時(shí),便依次讀出密碼子。首先是tRNAfMet結(jié)合在P位,隨后第二個(gè)氨酰tRNA進(jìn)入A位。此時(shí),在肽基轉(zhuǎn)移酶的催化下,P位和A位上的2個(gè)氨基酸之間形成肽鍵。第一個(gè)tRNA失去了所攜帶的氨基酸而從P位脫落,P位空載。A位上的氨酰tRNA在移位酶和GTP的作用下,移到P位,A位則空載。核糖體沿mRNA 5’端向3’端移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離。第三個(gè)氨酰tRNA進(jìn)入A位,與P位上氨基酸再形成肽鍵,并接受P位上的肽鏈,P位上tRNA釋放,A位上肽鏈又移到P位,如此反復(fù)進(jìn)行,肽鏈不斷延長(zhǎng),直到mRNA的終止密碼出現(xiàn)時(shí),沒有一個(gè)氨酰tRNA可與它結(jié)合,于是肽鏈延長(zhǎng)終止。
3)鏈終止
終止信號(hào)是mRNA上的終止密碼子(UAA、UAG或UGA)。當(dāng)核糖體沿著mRNA移動(dòng)時(shí),多肽鏈不斷延長(zhǎng),到A位上出現(xiàn)終止信號(hào)后,就不再有任何氨酰tRNA接上去,多肽鏈的合成就進(jìn)入終止階段。在釋放因子的作用下,肽酰tRNA的的酯鍵分開,于是完整的多肽鏈和核糖體的大亞基便釋放出來,然后小亞基也脫離mRNA。
基因表達(dá)翻譯后的加工:從核糖體上釋放出來的多肽需要進(jìn)一步加工修飾才能形成具有生物活性的蛋白質(zhì)。翻譯后的肽鏈加工包括肽鏈切斷,某些氨基酸的羥基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。真核生物在新生手肽鏈翻譯后將甲硫氨酸裂解掉。有一類基因的翻譯產(chǎn)物前體含有多種氨基酸順序,可以切斷為不同的蛋白質(zhì)或肽,稱為多蛋白質(zhì)(polyprotein)。例如胰島素(insulin)是先合成86個(gè)氨基酸的初級(jí)翻譯產(chǎn)物,稱為胰島素原(proinsulin),胰島素原包括A、B、C三段,經(jīng)過加工,切去其中無活性的C肽段,并在A肽和B肽之間形成二硫鍵,這樣才得到由51個(gè)氨基酸組成的有活性的胰島素。
要了解動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律,形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能,就必須搞清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念,掌握了基因調(diào)控機(jī)制,就等于掌握了一把揭示生物學(xué)奧秘的鑰匙。作為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的中心課題之一,基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控;②mRNA加工、成熟水平上的調(diào)控;③翻譯水平上的調(diào)控;
基因表達(dá)調(diào)控的指揮系統(tǒng)有很多種,不同生物使用不同的信號(hào)來指揮基因調(diào)控。原核生物和真核生物之間存在著相當(dāng)大差異。原核生物中,營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)起著十分重要的作用;而真核生物尤其是高等真核生物中,激素水平、發(fā)育階段等是基因表達(dá)調(diào)控的主要手段,營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響則為次要因素。
基因工程實(shí)施中的第二步是構(gòu)建基因表達(dá)載體(即目的基因與運(yùn)載體結(jié)合),也是基因工程的核心工作之一。其構(gòu)建目的是使目的基因能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時(shí),使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程如下:
首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒,使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)缺口,露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因,使其產(chǎn)生相同的黏性末端(部分限制性內(nèi)切酶可切割出平末端,擁有相同效果)。將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處,首先堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,兩個(gè)黏性末端吻合在一起,堿基之間形成氫鍵,再加入適量DNA連接酶,催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵,從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來,形成一個(gè)重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合,形成重組DNA分子(也叫重組質(zhì)粒)的。