放線菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

中英文名稱

規(guī)格

價(jià)格

說(shuō)明書(shū)

Actinomyces spp.

放線菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

50次

2490元

運(yùn)輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：2-3周

產(chǎn)品及特點(diǎn)

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供放線菌樣品。

2. 根據(jù)放線菌屬通用染料法熒光定量保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠50次20 L反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

規(guī)格及成分

成分

編號(hào)

十孔盒包裝

2 qPCR MagicMix

試劑一

500 L（棕色管）

熒光PCR專用模板稀釋液

試劑二

1 mL（黃蓋）

放線菌屬通用染料法熒光定量PCR引物混合物

試劑三

100 L（白蓋）

放線菌屬通用染料法熒光定量PCR陽(yáng)性對(duì)照

(1 10E8 拷貝/ L)

試劑四

50 L（紅蓋）

使用手冊(cè)

試劑五

1份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。

自備試劑 

DNA模板、10 ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。

使用方法

一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/ L這6個(gè)10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 L熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號(hào)管中加入5 L 1 10E8拷貝/ L 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1 10E7拷貝/ L的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 L 1 10E7拷貝/ L 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1 10E6拷貝/ L的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 L 1 10E6拷貝/ L的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1 10E5拷貝/ L的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0 L上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1 10E4 拷貝/ L，10 L相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1 10E5 拷貝/ L，10 L相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200 L樣品，則PC和NC的體積也必須是200 L。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 L體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）：

成分

樣品管

N+2個(gè)

PCR陰性對(duì)照管

PCR陽(yáng)性

對(duì)照管（2-7管）

2 qPCR MagicMix

（棕色管）

10  L

10  L

各10  L

放線菌屬通用染料法熒光定量PCR

引物混合液（白蓋）

2  L

2  L

各2  L

自備10 ROX (見(jiàn)注)

2 L

2 L

各2 L

 N+2待測(cè)樣品DNA模板

6  L

不加

不加

第7步所得PCR陽(yáng)性對(duì)照

稀釋液（2-7號(hào)）

不加

不加

各6 L（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管 ）

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過(guò)程

溫度

時(shí)間

預(yù)變性

92℃

5分鐘

PCR反應(yīng)

（30個(gè)循環(huán)）

92℃

60 秒

54℃

60 秒

72℃

60 秒

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。 

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。

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