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干貨分享：多肽類藥物雜質(zhì)的鑒定，提高雜質(zhì)鑒定的通量和準(zhǔn)確度

根據(jù)美國藥典（USP）多肽藥物指在不考慮工藝的條件下，氨基酸數(shù)目≤40屬于多肽藥物；當(dāng)采用化學(xué)合成方法制備時(shí)，其多肽藥物指氨基酸數(shù)目 100。

多肽類藥物的制備目前主要有化學(xué)合成、基因重組和從動(dòng)植物中提取三種方法。其中固相多肽合成技術(shù)的產(chǎn)生極大推動(dòng)了多肽藥物的發(fā)展，本篇主要利用雙三元液相與Orbitrap高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，鑒定了多肽類藥物胸腺法新的相關(guān)降解雜質(zhì)。

背 景

胸腺法新是由28個(gè)氨基酸組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量3108.28。注射用胸腺法新是胸腺法新加適量賦形劑制成的無菌凍干粉針，主要用于治療慢性乙肝、丙肝，也可與其他藥物聯(lián)用治療腫瘤、免疫缺陷等疾病。目前胸腺法新的合成方法主要為固相多肽法，合成步驟煩瑣，易產(chǎn)生與胸腺法新結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)[1]。

雜質(zhì)的類型主要分為兩類，一類為固相合成工藝相關(guān)的雜質(zhì)，如氨基酸的去除、插入、氧化以及殘留溶劑、試劑、無機(jī)雜質(zhì)等。另一類來源多肽的降解，如通過β-消除反應(yīng)、焦谷氨酸和琥珀酰亞胺的形成。通過對(duì)雜質(zhì)的深入分析可以指導(dǎo)工藝的改進(jìn)并保證用藥的安全性。當(dāng)相關(guān)的雜質(zhì)高于0.1%時(shí)需要體現(xiàn)，高于0.5%時(shí)需要進(jìn)行鑒定，高于1%時(shí)則需要精確定量，總雜質(zhì)的含量要小于5%[2]。

2015版中國藥典采用LC-UV主成分自身對(duì)照法對(duì)單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量進(jìn)行了規(guī)定，但標(biāo)準(zhǔn)方法中流動(dòng)相為硫酸銨緩沖液-乙腈系統(tǒng)由于緩沖液與質(zhì)譜不兼容，因此當(dāng)進(jìn)行雜質(zhì)鑒定時(shí)，傳統(tǒng)方法需對(duì)目標(biāo)雜質(zhì)峰進(jìn)行收集、富集、除鹽、旋干再鑒定，過程繁瑣、且增加了雜質(zhì)成分降解等不確定影響因素。

方 案 特 點(diǎn)

利用賽默飛特色的雙三元液相色譜多組分中心切割二維在線除鹽方法，可實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣即可完成多組分除鹽的目的，電霧式檢測(cè)器（CAD）作為一種通用型檢測(cè)器可輔助建立除鹽方法，評(píng)價(jià)除鹽效果。

在確定了二維除鹽條件后，利用Orbitrap高分辨質(zhì)譜的高分辨率、出色的靈敏度、高質(zhì)量精度等優(yōu)勢(shì)性能，對(duì)已在線脫鹽的未知雜質(zhì)組分進(jìn)行精確的鑒定。大大的提升了樣品的穩(wěn)定性和分析效率（全自動(dòng)在線多組分切割2DLC系統(tǒng)設(shè)計(jì)如下圖）。

全自動(dòng)在線多中心切割2DLC在線除鹽系統(tǒng)流路示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

實(shí) 驗(yàn) 方 法

液相方法

第一維液相方法同2015版藥典，各雜質(zhì)分離良好，其中面積歸一化含量在0.1%以上的雜質(zhì)共為11個(gè)，因此本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)11個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行定性鑒別。第二維除鹽過程采用AcclaimC18（300?），乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度分析，輔以CAD檢測(cè)，確定了二維的最佳除鹽和分離條件。

樣品在一維標(biāo)準(zhǔn)方法下的分離譜圖（上圖）及主要目標(biāo)雜質(zhì)被切割至第二維在線脫鹽后的典型總離子流圖（點(diǎn)擊查看大圖）

質(zhì)譜方法

一級(jí)全掃描：分辨率70,000;掃描范圍:300-1700m/z;

二級(jí)為數(shù)據(jù)依賴型掃描模式，分辨率35,000;歸一化碎裂能量（SteppedNCE）：20,23,26;動(dòng)態(tài)排除10s

數(shù)據(jù)處理

使用Thermo Scientific? BioPharmaFinder軟件，根據(jù)胸腺法新的氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)雜質(zhì)的鑒定。由于高分辨質(zhì)譜的高專屬性和高靈敏度的特性，因此每個(gè)雜質(zhì)組分中會(huì)鑒定到多種成分。氨基酸序列性質(zhì)相似時(shí)，其離子化效率接近，根據(jù)其質(zhì)譜中的相對(duì)豐度可對(duì)每個(gè)組分中的每一成分進(jìn)行初步的相對(duì)定量（注：主成分切到質(zhì)譜中進(jìn)行鑒定只是少部分）。1-6雜質(zhì)組分的鑒定結(jié)果下圖，7-11組分的鑒定結(jié)果如圖3B，每一成分的一級(jí)質(zhì)量偏差均小于2ppm。

雜質(zhì)組分1-6的鑒定結(jié)果（圖上數(shù)字代表該成分的保留時(shí)間）（點(diǎn)擊查看大圖）

雜質(zhì)組分7-11的鑒定結(jié)果（點(diǎn)擊查看大圖）

小 結(jié)

傳統(tǒng)在線除鹽方法多采用1個(gè)或2個(gè)loop環(huán)進(jìn)行目標(biāo)物收集，但當(dāng)樣品雜質(zhì)較多，且標(biāo)準(zhǔn)方法分析時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)（本實(shí)驗(yàn)樣品分析時(shí)間為60min），將極大的影響雜質(zhì)的分析效率，而手工收集也可能會(huì)引入其他降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。

采用6個(gè)loop環(huán)的多中心切割方法，一次進(jìn)樣可完成多目標(biāo)雜質(zhì)的在線除鹽，顯著的提高鑒定的通量，同時(shí)與Orbitrap高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，提高雜質(zhì)鑒定的通量和準(zhǔn)確度，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]程磊,唐洋明,殷果,等.HPLC法對(duì)胸腺法新及其制劑中雜質(zhì)檢查[J].藥物分析雜志,2013(11):1942-1947.

[2]D’hondt,Matthias,etal. Relatedimpuritiesinpeptidemedicines. Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis101(2014):2-30.

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