目的
探討非專(zhuān)業(yè)加工制作的麥秸墊料、玉米芯墊料、刨花墊料和紙質(zhì)墊料對(duì)SPF級(jí)昆明小鼠(KM)學(xué)習(xí)記憶能力的影響差異,以及不同墊料對(duì)小鼠行為學(xué)的影響。方法選用SPF級(jí)KM小鼠24只,分別使用麥秸墊料、刨花、玉米芯和紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)8周后,開(kāi)展 MORRIS水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn),考察其行為學(xué)的變化和學(xué)習(xí)記憶能力的差異。
結(jié)果
麥秸組學(xué)習(xí)記憶能力增加明顯高于刨花組(P 0.05);水迷宮實(shí)驗(yàn)期間,各組增重差異不顯著。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,麥秸組第5d的逃避潛伏期顯著低于其余三組(P 0.05),其余時(shí)間段差異無(wú)顯著性;空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示麥秸組小鼠穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)、游泳時(shí)間均多于其余三組。
結(jié)論
不同墊料對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)中KM小鼠的體質(zhì)量影響較小,麥秸墊料對(duì)KM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響優(yōu)于刨花墊料和玉米芯墊料,建議將麥秸墊料作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸性墊料推廣使用。
 
墊料是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境中的接觸性基礎(chǔ)材料,不同的墊料生存環(huán)境直接影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理活動(dòng),進(jìn)而影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇不同墊料也是體現(xiàn)動(dòng)物福利的重要內(nèi)涵。因此,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料的物理性狀、化學(xué)及生物特性都有明確的規(guī)定和要求。目前所知實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、品系、年齡、性別等對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶能力均有不同程度的影響,但未知不同墊料飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶認(rèn)知能力是否有影響。為了進(jìn)一步探索新型麥秸墊料的安全性及其對(duì)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸環(huán)境的影響,本實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)昆明小鼠為研究對(duì)象,應(yīng)用 MORRIS水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,比較、開(kāi)發(fā)利用新型麥秸墊料和其他3種墊料(刨花墊料、玉米芯墊料和紙質(zhì)墊料)在工作狀態(tài)下對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和血液生化指標(biāo)的影響。為今后開(kāi)展與改善學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)藥物研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料選擇提供參考,也為新型麥秸墊料的安全使用和大力推廣提供依據(jù)。
 
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)KM小鼠(孕13d)8只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016 0006],飼養(yǎng)在北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心屏障內(nèi),小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，溫度:18~26℃,濕度:38%~50%。維持12/12h暗交替光照。所有實(shí)驗(yàn)操作遵循動(dòng)物使用相要求,福利倫理審查批準(zhǔn)號(hào): BLARC2017112401。
1.2墊料及主要儀器
1.2.Ⅰ新型麥秸墊料:利用蒸汽爆破工藝對(duì)麥秸原料進(jìn)行爆破,做進(jìn)一步處理后,進(jìn)行Co照射及真空包裝后獲得新型麥秸墊料。玉米芯墊料、刨花料均購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司;紙質(zhì)墊料購(gòu)自北京美綠洲生物科技有限公司。
1.2.2主要儀器:超凈工作臺(tái)(蘇杭);電子天平 (Sartorius,BSA220ZS型):水迷宮(ZS40 ZS001 MORRIS水迷宮動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(眾實(shí)迪創(chuàng)購(gòu)自北京美綠洲生物科技有限公司)。
1.3方法
1.3.1實(shí)驗(yàn)分組:8只KM孕鼠單籠飼養(yǎng),2只/籠分別飼養(yǎng)在麥秸墊料、玉米芯、刨花和紙質(zhì)4種墊料中。選取離乳后仔鼠24只,隨機(jī)分為4組,每組6只,雌雄各半,分別按照使用墊料的不同分為麥秸墊料組、玉米芯組、刨花組和紙質(zhì)墊料組。每周更換次墊料,常規(guī)飼養(yǎng)。在相同環(huán)境條件下繼續(xù)飼養(yǎng)8周后,觀察各組小鼠的相應(yīng)指標(biāo)。
1.3.2適應(yīng)性觀察:觀測(cè)KM小鼠分別對(duì)4種墊料飼養(yǎng)適應(yīng)情況,觀察小鼠行為反應(yīng)、身體清潔度、有無(wú)外傷及過(guò)敏、嚼食墊料等情況。
1.3.3水迷宮行為學(xué)測(cè)試:應(yīng)用ZS-01 MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置,開(kāi)展隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠在水迷宮裝置中的學(xué)習(xí)和記憶能力。
1.3.3.1定位航行實(shí)驗(yàn):連續(xù)6d分別對(duì)麥秸、刨花、玉米芯及紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)的4組小鼠進(jìn)行入水訓(xùn)練和測(cè)試,每天訓(xùn)練4次,確保4個(gè)象限每天只用1次。第一天為適應(yīng)性訓(xùn)練,將小鼠放入不含平臺(tái)的水池中自由游泳120s,每次訓(xùn)練完成后,迅速用干凈的干毛巾將小鼠擦拭干凈后放回籠盒,并保證其飲水和食物供應(yīng),便于小鼠提前適應(yīng)環(huán)境,減少應(yīng)激反應(yīng)。其余5d為正式試驗(yàn),每天固定時(shí)間訓(xùn)練4次,每次訓(xùn)練間隔15~20min。訓(xùn)練時(shí)間設(shè)置為90s,90s內(nèi)小鼠未找到站臺(tái),則由實(shí)驗(yàn)人員將其引導(dǎo)至站臺(tái),并在站臺(tái)上停留10s,逃避潛伏期記為90s。將逃避潛伏期均值作為參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
1.3.3.2空間探索實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1d,去除平臺(tái)中心支架,任選一個(gè)象限入水點(diǎn)將KM小鼠放入水中,測(cè)試60s小鼠在恒溫池中的游泳時(shí)間以及目標(biāo)(原平臺(tái)位置)的次數(shù)。 1.3.4體質(zhì)量的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)期間,每天實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱(chēng)重并記錄
1.4統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差( s)表示,各組間逃避潛伏期和體質(zhì)量的比較采用ISD方差分析;各組間穿越站臺(tái)次數(shù)采用單因素方差分析,P 0.05為差異有顯著性。
2結(jié)果
2.1動(dòng)物適應(yīng)性研究
通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察,麥秸墊料對(duì)小鼠無(wú)刺激作用,小鼠行為、反應(yīng)正常。同其他3種墊料相比,換墊料1周后,麥秸墊料相對(duì)干燥度良好;相比玉米芯墊料沒(méi)有尿液集中滲漏的情況;相比紙質(zhì)墊料,沒(méi)有排泄物裸置的情況。
2.2定位航行實(shí)驗(yàn)
逃避潛伏期結(jié)果如表1所示。在5d的定位航行實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠的潛伏期均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短,由此可知,在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力。由圖1可見(jiàn),自第2天起,麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢(shì),其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的潛伏期進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示,第5天的潛伏期麥秸組顯著低于其他3組(P 0.05),其余各組間兩兩比較差異不顯著,由此可見(jiàn)經(jīng)麥秸墊料飼養(yǎng)下的KM小鼠在空間學(xué)習(xí)能力可得到明顯的提高。 2.3空間探索實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,各組小鼠穿過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間經(jīng)統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P 0.05)。但麥秸組的小鼠在穿過(guò)目標(biāo)象限的總次數(shù)、游泳時(shí)間上均表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì),其中穿臺(tái)次數(shù)方面:麥秸組(3、2)最高、刨花組(1、2)、玉米芯組(1、2),紙質(zhì)組(1);游泳時(shí)間方面:麥秸組(17.09s)、刨花組(1122)、玉米芯組(12.21)、15紙質(zhì)組(16.33s)。這說(shuō)明在麥秸墊料飼養(yǎng)條件下的KM小鼠可獲得良好的空間學(xué)習(xí)記憶能力,其對(duì)空間定位的準(zhǔn)確性明顯高于其他3組。 2.4墊料對(duì)KM小鼠體質(zhì)量的影響
KM小鼠經(jīng)四種不同墊料相同飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)8周后,體質(zhì)量均逐漸增加,結(jié)果見(jiàn)表2。其中麥秸組增重最大,刨花組增重最小,兩組間變化差異顯著(P 0.05);水迷宮測(cè)試期間,各組增重兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05),結(jié)果如圖3所示。 3討論
 
目前,MORS水迷宮實(shí)驗(yàn)廣泛用于開(kāi)展海馬與腦認(rèn)知系統(tǒng)的相關(guān)研究方面。如 Huang等研究脂多糖對(duì)記憶檢索的影響,探討免疫激活與學(xué)習(xí)記憶功能的相互作用。 Stackman等研究小鼠定向反應(yīng)與前丘腦神經(jīng)元之間的關(guān)聯(lián)。范琳犀等研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮慢性注射可誘導(dǎo)C57小鼠抑郁行為發(fā)生改變并損害學(xué)習(xí)記憶功能。劉港等研究結(jié)果表明,采用雄性KM小鼠側(cè)腦室注射AB23-35可快速成功制備阿爾茨海默病(AD)小鼠模型。在定位航行實(shí)驗(yàn)中,KM小鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而減少,這與本研究的結(jié)果一致。王南溪等用水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試不同劑量的黃粉蟲(chóng)油脂對(duì)KM小鼠增重及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。胡華等探討活血榮絡(luò)片治療阿爾茨海默病的機(jī)制。在MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,其測(cè)試結(jié)果不僅與動(dòng)物種類(lèi)有關(guān), MORRIS水迷宮的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境(光照、噪聲)等許多因素均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。周海東等發(fā)現(xiàn)平臺(tái)顏色可以改變大鼠的水迷宮成績(jī)藍(lán)色平臺(tái)的大鼠學(xué)習(xí)能力提升速度快于白色平臺(tái)組。黃明2發(fā)現(xiàn)90dB的噪聲(2h/天)可以導(dǎo)致KM小鼠空間性學(xué)習(xí)記憶能力和情緒性記憶能力受損。 眾所周知,墊料作為嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境中的重要組成部分,其原料、形狀、大小等因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有不同程度的影響3。越來(lái)越多的研究表明,豐富環(huán)境可以對(duì)小鼠腦損傷具有復(fù)蘇的作用,可以改善其記憶和運(yùn)動(dòng)能力,認(rèn)為環(huán)境豐富化對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦功能改善、減輕老齡化帶來(lái)的空間認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)缺陷等具有重要生物學(xué)意義。唐莉莉6研究發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境組的KM小鼠表現(xiàn)活躍,探索主動(dòng)性增加,豐富環(huán)境強(qiáng)化小鼠的情緒學(xué)習(xí)記憶;而貧瘠環(huán)境組小鼠活動(dòng)減少、情緒煩躁不安,氧化應(yīng)急水平下降,使機(jī)體抵抗外界不良環(huán)境的能力下降。吳冰潔等通過(guò)對(duì)近交系衰老模型SAMP8小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了環(huán)境豐富能刺激、提高動(dòng)物體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH和皮質(zhì)醇(Cor)水平,能減輕精神行為異常及顯著提高小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。李春祿等通過(guò)對(duì)野生小家鼠和KM小鼠對(duì)豐富環(huán)境(鋸末墊料為主,普通環(huán)境基礎(chǔ)上添加玩具)的學(xué)習(xí)記憶能力影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)早期的豐富環(huán)境飼養(yǎng)顯著縮短野生小家鼠的潛伏期,KM小鼠沒(méi)有顯著影響,而經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練野生小家鼠和KM小鼠的潛伏期都顯著縮短。野生小家鼠更有良好的可塑性和應(yīng)變能力,而實(shí)驗(yàn)KM小鼠經(jīng)過(guò)馴化后對(duì)環(huán)境變化更容易適應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)選用KM小鼠作為研究對(duì)象,這與我們的研究結(jié)果致。但是,在刨花與玉米芯等常規(guī)墊料飼養(yǎng)中,結(jié)果顯示在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力,自第2天起,麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢(shì),其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢(shì),但差異不顯著。 據(jù)報(bào)道,大小鼠的迷宮實(shí)驗(yàn)認(rèn)知和行為評(píng)價(jià)的差異也可能和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),應(yīng)激狀態(tài)下人類(lèi)和動(dòng)物釋放的腎上腺皮質(zhì)激素影響記憶的形成,損害記憶的獲得和再現(xiàn)。在水迷宮浸水游泳的環(huán)境應(yīng)激下,除了因整體環(huán)境因素如墊料富集,增加小鼠的幸福感等對(duì)小鼠形成的保護(hù)作用,也應(yīng)該考慮到小鼠個(gè)體差異。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn),雌性小鼠的認(rèn)知能力顯著高于雄性,這與宿瑞敏研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),新型麥秸墊料可促進(jìn)KM小鼠體質(zhì)量增加,且增加情況要優(yōu)于玉米芯和紙質(zhì)墊料組,與刨花墊料組相比較差異顯著(P 0.05);舒暢等凹曾報(bào)道普通刨花墊料對(duì)KM小鼠體質(zhì)量的增加緩慢,本次結(jié)果與之相一致。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,4種墊料飼養(yǎng)下的小鼠差異不顯著,但結(jié)合實(shí)際飼養(yǎng)環(huán)境來(lái)看,紙質(zhì)墊料組的小鼠表現(xiàn)欠佳,不建議完全用紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)或開(kāi)展相關(guān)研究。麥秸墊料組表則明顯優(yōu)于刨花墊料和玉米芯墊料組,因此麥秸墊料可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸性墊料推廣使用。
 
 
參考文獻(xiàn)
 
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