精準(zhǔn)醫(yī)療使醫(yī)療技術(shù)獲得了飛躍式的發(fā)展進(jìn)步，多項(xiàng)研究成果表明，基于CRISPR/Cas9的基因療法在遺傳病治療中有很大的應(yīng)用前景。2017年，Spark公司的創(chuàng)新基因療法Luxturna獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療患有特定遺傳性眼疾的成人和兒童患者，為基因療法研究注入了一劑強(qiáng)心劑。

2月18日，《自然醫(yī)學(xué)》雜志同期發(fā)表了三篇基因療法相關(guān)文章，展示了基于CRISPR/Cas9的基因療法治療罕見(jiàn)遺傳病的突破性研究成果。

在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）基因治療長(zhǎng)期療效及安全性研究中，杜克大學(xué)的研究人員已經(jīng)證明，基于CRISPR的基因療法可以在一年的時(shí)間里，安全、穩(wěn)定地糾正小鼠體內(nèi)的DMD。研究中也觀察到了免疫反應(yīng)和脫靶效應(yīng)，但目前的研究結(jié)果顯示該療法是安全有效的，后續(xù)仍需進(jìn)行仔細(xì)地監(jiān)測(cè)驗(yàn)證研究。接下來(lái)，我們重點(diǎn)了解一下這項(xiàng)研究。

該研究由杜克大學(xué)Charles Gersbach教授領(lǐng)導(dǎo)完成，其研究團(tuán)隊(duì)自2009年起就致力于DMD的基因療法研究開(kāi)發(fā)。DMD由抗肌萎縮蛋白（Dystrophin）的編碼基因突變導(dǎo)致。如果編碼抗肌萎縮蛋白的一個(gè)或多個(gè)外顯子發(fā)生突變，機(jī)體就無(wú)法產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉緩慢地?cái)嗔押屯嘶??；谠摍C(jī)制，Gersbach教授研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR的基因療法（AAV為載體）。該療法是利用CRISPR/Cas9切斷抗肌萎縮蛋白外顯子周圍發(fā)生突變的基因，再利用人體的自然DNA修復(fù)系統(tǒng)將剩下的基因重新“縫合”在一起，從而產(chǎn)生一個(gè)縮短的、具有正常功能的抗肌萎縮蛋白編碼基因。

在動(dòng)物模型試驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)選用了成年和新出生的DMD小鼠模型。研究人員為DMD小鼠模型實(shí)施了單劑量靜脈注射的上述基因療法，并進(jìn)行了追蹤。前8周研究結(jié)果顯示，小鼠的抗肌萎縮蛋白功能得到恢復(fù)，肌肉力量增強(qiáng)，表明該基因療法確實(shí)有效。

此前的DMD治療研究都集中于抗肌萎縮蛋白的短期恢復(fù)，通常在治療后4-8周進(jìn)行評(píng)估。然而，基因編輯會(huì)導(dǎo)致永久性的基因改變，所以探索該基因療法可能帶來(lái)其他后果，以及療效的持久性至關(guān)重要。在接下來(lái)的一年中，研究人員對(duì)注入小鼠體內(nèi)的CRISPR系統(tǒng)編輯效果進(jìn)行了檢測(cè)跟蹤。令人驚喜的是，研究結(jié)果表明，該療法不僅成功編輯了小鼠體內(nèi)的缺陷基因，并使其獲得了長(zhǎng)期表達(dá)抗肌萎縮蛋白的能力，所有的老鼠在治療一年后都表現(xiàn)良好！

除了療效，基因編輯的脫靶問(wèn)題也非常惹人關(guān)注。為了全面研究該基因療法產(chǎn)生的所有基因編輯事件，研究團(tuán)隊(duì)采用了一種DNA測(cè)序方法，該方法可報(bào)告任何基因編輯類型。研究發(fā)現(xiàn)，除了預(yù)期的目標(biāo)外顯子外，還有許多種其他編輯類型，包括來(lái)自CRISPR/Cas9系統(tǒng)病毒載體的高水平DNA序列插入。

經(jīng)過(guò)對(duì)組織類型和CRISPR輸送劑量進(jìn)行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，多達(dá)一半的基因編輯會(huì)導(dǎo)致這些脫靶效應(yīng)。雖然該結(jié)果令人驚訝，但目前的研究數(shù)據(jù)顯示，這些非預(yù)期的DNA序列變化并不會(huì)影響該基因療法對(duì)DMD的治療效果和安全性。雖然如此，研究人員表示，任何非預(yù)期的基因編輯結(jié)果都有潛在的價(jià)值，這些基因編輯事件在未來(lái)研究的方法設(shè)計(jì)、識(shí)別和減少脫靶效應(yīng)中都有重要作用。

圖：未治療DMD小鼠模型（左）和使用該基因療法治療一年后的DMD小鼠模型（右）。綠色表示抗肌萎縮蛋白基因表達(dá)水平較高，黑斑表示來(lái)自小鼠的T細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌Cas9蛋白，表明存在免疫反應(yīng)。

此外，已有研究表明小鼠的免疫系統(tǒng)可對(duì)Cas9產(chǎn)生反應(yīng)，這可能干擾CRISPR的編輯效果。為此，研究團(tuán)隊(duì)還監(jiān)測(cè)了小鼠模型對(duì)Cas9蛋白產(chǎn)生的所有免疫反應(yīng)。研究人員在成年小鼠模型中觀察到了抗體和T細(xì)胞對(duì)Cas9的反應(yīng)，但這些免疫反應(yīng)似乎都沒(méi)有在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生任何毒性，且沒(méi)有影響治療效果；新出生的小鼠模型則沒(méi)有類似的免疫反應(yīng)。同時(shí)，研究人員也在開(kāi)發(fā)新的策略來(lái)限制Cas9的表達(dá)或在短時(shí)間內(nèi)僅將CRISPR/Cas9系統(tǒng)輸送到肌肉細(xì)胞，以減少可能的免疫反應(yīng)。

與該研究同期發(fā)表的還有另外兩篇文章，都是針對(duì)早衰綜合征（HGPS）的基因治療展開(kāi)，文章題目分別為“Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome”和“Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome”。前一項(xiàng)研究由西班牙和英國(guó)科學(xué)家合作完成，后一項(xiàng)由美國(guó)索爾克生物研究所科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)完成。

HGPS是由LMNA基因點(diǎn)突變引起的一種罕見(jiàn)致死性遺傳病。該病的患者自童年開(kāi)始就快速地衰老，目前還沒(méi)有針對(duì)HGPS的有效治療。已有研究發(fā)現(xiàn)，Lamin A蛋白的編碼基因LMNA的突變，促使機(jī)體產(chǎn)生了孕激素有毒異構(gòu)體，這是HGPS的主要致病原因。

在西班牙科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的研究中，研究人員探討了一種基于CRISPR/Cas9基因療法的有效性，該方法通過(guò)在LMNA基因中引入移碼突變，阻斷Lamin A蛋白和孕激素的積累，來(lái)恢復(fù)HGPS引起的細(xì)胞成分的變化。研究結(jié)果顯示，該基因療法可廣泛地改善HGPS小鼠的表型，并延長(zhǎng)壽命。

在由美國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的最新研究中，研究人員通過(guò)單劑量全身性注射AAV病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9組分，來(lái)降低小鼠模型中的Lamin A蛋白/孕激素水平，以抑制HGPS的發(fā)生。研究結(jié)果顯示，該基因療法改善了HGPS小鼠的健康狀況，并延長(zhǎng)了小鼠的壽命。以上兩項(xiàng)研究均展示了CRISPR/Cas9在HGPS小鼠模型中的治療效果，也為在其他目前無(wú)法治愈的罕見(jiàn)疾病中使用CRISPR/Cas9開(kāi)辟了道路。

基因療法已經(jīng)引起了各國(guó)科學(xué)家和跨國(guó)制藥巨頭的關(guān)注。2018年12月1日，美國(guó)FDA已經(jīng)接受Editas Medicine公司為EDIT-101遞交的IND申請(qǐng)，允許該公司開(kāi)展使用CRISPR基因編輯手段治療Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的臨床試驗(yàn)。EDIT-101有望成為世界上第一款在人體內(nèi)使用的CRISPR療法。此外，還有多項(xiàng)針對(duì)艾滋病、血友病、地中海貧血、心血管病、腎病、肺病等疾病的基因療法研究正在進(jìn)行，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。希望隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，更多安全有效的基因療法能夠開(kāi)發(fā)出來(lái)，為推進(jìn)科學(xué)和人類健康進(jìn)步貢獻(xiàn)力量。

參考資料：

1. Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy

2. Single CRISPR treatment provides long-term benefits in mice

3. Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome

4. Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome