2018年2月7日，華盈生物合作伙伴上海中醫(yī)藥大學(xué)楊永清教授研究團(tuán)隊(duì)在完成的最新研究中指出，臨床有效的針刺抗哮喘治療方法可顯著提高金屬硫蛋白-2 (MT-2)蛋白含量，其受體TG2是治療哮喘的新靶標(biāo)。該研究不僅在針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面取得了重大進(jìn)展，更為哮喘病治療藥物的開發(fā)開啟了大門。這一項(xiàng)突破性研究結(jié)果作為封面文章發(fā)表在2018年2月7日出版的頂級學(xué)術(shù)期刊《Science Translational Medicine》上。這是繼2017年針灸治療臨床試驗(yàn)相關(guān)文章發(fā)表在國際頂級期刊JAMA之后， CNS刊登的首篇針灸機(jī)理研究文獻(xiàn)。
 

研究背景簡介
 

 哮喘是當(dāng)今世界上最常見的氣道慢性炎癥疾病之一，該病的發(fā)生與遺傳因素、環(huán)境因素、呼吸感染等諸多因素相關(guān)。期間會有氣管狹窄，導(dǎo)致后續(xù)肺阻力的出現(xiàn)，而舒張氣管平滑肌細(xì)胞是緩解氣喘，降低肺阻力的有效途徑。臨床上防治哮喘的藥物主要有 2受體激動劑、抗膽堿藥、糖皮質(zhì)激素等。然而這些藥物本身具有不用程度的副作用，而且長期攝入可以導(dǎo)致耐藥性增加，使病情無法緩解。因此迫切需要開發(fā)新的哮喘治療藥物。
 

 在中醫(yī)界，幾十年來年來運(yùn)用針刺大椎、風(fēng)門等穴位，可以顯著改善哮喘患者呼吸功能。針刺具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，為挖掘針灸改善哮喘深層機(jī)制，楊永清教授研究團(tuán)隊(duì)將研究重點(diǎn)聚焦在了金屬硫蛋白2（MT-2）上，MT-2屬于金屬硫蛋白家族，通常在氣管上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中保守表達(dá)。雖然已有報(bào)道證實(shí)金屬硫蛋白在內(nèi)毒素血癥中能保護(hù)肺部的氧化應(yīng)激，但尚未發(fā)現(xiàn)MT-2在哮喘研究方向的相關(guān)報(bào)道。楊教授研究團(tuán)隊(duì)以MT-2為研究起點(diǎn)，在其對哮喘的治療應(yīng)用方面展開了系統(tǒng)性研究，見圖1。
 

圖1 技術(shù)路線

文獻(xiàn)解讀
 

  雖然臨床針刺可以顯著防治哮喘，但具體機(jī)制研究并不明確。為了首先理清哮喘發(fā)病機(jī)制，研究人員建立了OVA誘導(dǎo)大鼠過敏性哮喘模型，并分析了肺組織中MT-2蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)哮喘模型組中MT-2表達(dá)量下降超過50%。
 

金屬硫蛋白水平的下調(diào)是不是哮喘發(fā)生的原因呢？
 

  為驗(yàn)證這個推測，科研人員通過基因敲除手段驗(yàn)證了MT-KO小鼠哮喘的易發(fā)性，發(fā)現(xiàn)MT敲除小鼠比哮喘模型組有更高的肺阻力！應(yīng)用重組MT-2蛋白進(jìn)行反證的結(jié)果與之高度呼應(yīng)：通過頸外靜脈注射MT-2到哮喘大鼠體內(nèi)可以顯著降低肺阻力！同時，研究人員還將MT-2與FDA批準(zhǔn)的哮喘治療藥物特布他林(TB）和氫化可的松(HC)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)0.1 g/kg 的MT-2即可達(dá)到劑量高達(dá)550倍，甚至150000倍的傳統(tǒng)哮喘治療藥物的效果。更讓人不可思議的是，肺阻力在注射MT-2后的3分鐘-8分鐘就有顯著下調(diào)，并且MT-2可以更加有效地降低乙酰膽堿（ACh）引起的氣管平滑肌細(xì)胞（ASMCs）的收縮。如此的低劑、高效的MT-2讓研究人員振奮不已！見圖2。
 

圖2 MT-2能有效快速治療哮喘

  研究人員通過共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)MT-2定位到ASMCs細(xì)胞膜上。通過進(jìn)行MT-2與ASMCs結(jié)合分析，證實(shí)存在受體介導(dǎo)MT-2和ASMCs的結(jié)合。為找到這個中間受體，科研人員采用傳統(tǒng)的pull down + LC-MS/MS技術(shù)，鑒定到細(xì)胞膜中與MT-2結(jié)合的兩個蛋白：Enolase-1和TG2。但在進(jìn)一步的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有TG2的阻斷抗體能抑制MT-2和ASMCs的結(jié)合，因此將研究重心鎖定在MT-2結(jié)合受體TG2上。后續(xù)的系列細(xì)胞結(jié)合檢測、共聚焦觀察、分子動力學(xué)SPR分析結(jié)果均證實(shí)MT-2能在ASMCs細(xì)胞膜上結(jié)合受體TG2。
 

圖3 MT-2特異性結(jié)合受體TG2

  為進(jìn)一步確證TG2對MT-2有效舒張ASMCs能產(chǎn)生影響，科研人員通過基因敲除手段分析了MT-2對TG2-KO鼠ASMCs的影響。發(fā)現(xiàn)一旦敲除TG2，MT-2對ASMCs的有效舒張也隨之消失，且過敏性哮喘模型鼠更易發(fā)生哮喘！
 

 MT-2通過結(jié)合TG2舒張ASMCs的內(nèi)在機(jī)制是怎樣的呢？
 

  楊永清教授研究團(tuán)隊(duì)對MT-2可能參與影響的信號通路情況進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。面對細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路，研究人員果斷采用信號通路磷酸化廣譜芯片PEX100（一次芯片實(shí)驗(yàn)即可完成31條信號通路磷酸化調(diào)變的全譜篩選），對用MT-2處理的大鼠ASMCs，以及對照組一同進(jìn)行蛋白芯片檢測。芯片篩選以及WB驗(yàn)證結(jié)果均顯示MT-2最大程度的誘導(dǎo)Ezrin的磷酸化和MYPT1的去磷酸化水平。后續(xù)的Co-IP和SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ezrin是唯一能跟TG2共結(jié)合的蛋白。根據(jù)已有報(bào)道，Ezrin是一種細(xì)胞骨架蛋白，參與膜受體復(fù)合物的穩(wěn)定。研究人員推測Ezrin可能通過調(diào)節(jié)TG2定位和肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用，最終助力MT-2舒張ASMCs，見圖4。
 

圖4 MT-2通過TG2舒張ASMCs

 鑒于MT-2通過TG2舒張ASMCs，TG2作為哮喘治療新靶標(biāo)，是否可以開發(fā)TG2激動劑來治療哮喘呢？
 楊教授研究團(tuán)隊(duì)與中科院上海藥物研究所所長蔣華良早在2003年就成立 針灸中藥效應(yīng)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 ，他們繼續(xù)展開了緊密合作。利用分子對接等技術(shù)從6000個化合物中篩選TG2結(jié)合分子，并對排名前21的化合物逐一進(jìn)行SPR分子動力學(xué)的驗(yàn)證工作，其中化合物TSG12展現(xiàn)出最大強(qiáng)度的特異性結(jié)合TG2的能力。后續(xù)研究人員通過系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)和動物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對TSG12進(jìn)行了藥效評價。結(jié)果顯示：注入小鼠體內(nèi)的TSG12主要在氣管和肺部積累，其可以通過TG2促進(jìn)ASMCs的舒張，有效舒展氣道，降低肺阻力，從而達(dá)到哮喘治療效果。在分子機(jī)制研究層面，研究人員以蛋白芯片篩選結(jié)果中MYPT1的去磷酸化為研究線索，通過WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSG12的處理也可以誘導(dǎo)MYPT1Thr853的去磷酸化。已知MYPT1Thr853可以激活下游的MLCP,去磷酸化MLC，最終導(dǎo)致肌肉舒張。同時，研究人員也對MYPT1Thr853的上游進(jìn)行驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)TSG12可以誘導(dǎo)RhoASer188的磷酸化和ROCKTyr722的去磷酸化水平。最終，研究人員將整個分子機(jī)制串聯(lián)起來，TSG12可以抑制RhoA（已知RhoA的磷酸化可以抑制RhoA），通過調(diào)節(jié)RhoA-ROCK-MYPT1-MLC通路促進(jìn)MLC去磷酸化，最終舒張ASMCs，見圖5。
 

圖5 TSG12治療哮喘表型和機(jī)制分析

 
  最后，研究人員在哮喘模型動物中對TSG12的哮喘治療效果做了進(jìn)一步驗(yàn)證評價。證實(shí)具有TSG12能有效舒張氣管平滑肌，顯著降低肺阻力，具有 類針刺 作用效果。與臨床防治哮喘藥物 2受體激動劑相比，TSG12對TG2受體并沒有產(chǎn)生脫敏影響，是一種效果極其優(yōu)秀的哮喘治療新藥物，具有良好臨床應(yīng)用前景，如圖6。
 

圖6  TSG12哮喘治療評價
 

小結(jié)：
 

 本研究不僅是中醫(yī)藥基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域的代表案例，也為所有臨床相關(guān)基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供了經(jīng)典的思路：從臨床總結(jié)中發(fā)現(xiàn)科學(xué)問題 利用蛋白組學(xué)等實(shí)驗(yàn)手段理解相關(guān)機(jī)制 提出改善臨床問題的新方案。值得一提的是，蛋白質(zhì)是絕大多數(shù)藥物治療的靶點(diǎn)，也是針灸等傳統(tǒng)醫(yī)療手段的效應(yīng)物質(zhì)。本文以尋找替代針灸治療的藥物靶點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，一開始即進(jìn)行了一系列的蛋白質(zhì)篩選和鑒定工作，目標(biāo)明確，成果顯著，值得推廣。

英文文獻(xiàn)原文：http://stm.sciencemag.org/content/10/427/eaam8604