DAPK1蛋白；死亡關(guān)聯(lián)蛋白激酶1(DAPK1)重組蛋白

英文名稱(chēng)：Recombinant Death Associated Protein Kinase 1 (DAPK1)

來(lái)源：原核表達(dá)

宿主：E.coli

規(guī)格：10μg  50μg  200μg  1mg  5mg

內(nèi)毒素水平： 1.0EU/μg(LAL法測(cè)定)具體詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

片段與標(biāo)簽：N-terminal His Tag

物種來(lái)源（人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、獼猴、山羊、綿羊、馬、牛、豬、雞、狗等其他物種多物種）相同的名稱(chēng)，不同的物種。

性狀：凍干粉

表達(dá)系統(tǒng)：  大腸桿菌

產(chǎn)品純度： 95%-98%（SDS-PAGE RP-HPLC）

保存條件：如果樣品在2-4周內(nèi)使用，可以在4°C低溫儲(chǔ)存。

DAPK1蛋白；死亡關(guān)聯(lián)蛋白激酶1(DAPK1)重組蛋白有幾個(gè)疑點(diǎn)：

1、表達(dá)量如何？

2、超聲過(guò)程中注意冰水浴了嗎？

3、“蛋白條帶由1條變成3條”是不是說(shuō)表達(dá)后的全菌電泳目標(biāo)蛋白是一條帶，而在超聲或溶菌酶處理后這1條帶降解成了3條？

4、降解成的3條帶中還有原來(lái)的融合蛋白條帶嗎，量如何？

5、變性純化后的純度如何？

6、能否把相關(guān)電泳圖發(fā)上來(lái)看看？

答：蛋白表達(dá)量不高，但也不低；

超聲過(guò)程一直是在冰上進(jìn)行的；

全菌電泳目的蛋白是一條帶；

降解成3條帶后，大部分情況下是有目的融合蛋白的，量比較少；

變性純化后純度還是挺不錯(cuò)的。

DAPK1蛋白；死亡關(guān)聯(lián)蛋白激酶1(DAPK1)重組蛋白兩個(gè)建議：

1、用非變性純化樣品去做EK酶切、純化。

如果融合蛋白的降解是從N端開(kāi)始的，而C端沒(méi)有降解，那么應(yīng)該能夠拿到38肽。

我曾經(jīng)有個(gè)這么個(gè)類(lèi)似情況，酶切后證實(shí)是N端降解，C端的目的蛋白好好的，大小都對(duì)。

做EK酶切多了，往往會(huì)發(fā)現(xiàn)，PET32a的融合段硫氧還蛋白加histag部分確實(shí)易被進(jìn)一步酶切水解。但Ni柱的結(jié)合特性不變，說(shuō)明水解是從N端開(kāi)始的。

先做酶切梯度，電泳確定酶量標(biāo)準(zhǔn)。不要用酶說(shuō)明書(shū)的量，有時(shí)候差距非常大。和蛋白種類(lèi)相關(guān)。

酶切后的純化方法選Ni柱穿透純化，可能要加少許咪唑及鹽，以利用酶切后的目標(biāo)蛋白不吸附Ni柱。

2、用變性純化的樣品做復(fù)性處理

DAPK1蛋白；死亡關(guān)聯(lián)蛋白激酶1(DAPK1)重組蛋白變性純化的樣品純度不錯(cuò)，查閱一下有關(guān)的復(fù)性方法資料，設(shè)計(jì)一個(gè)方案。

你用超濾和透析的方法都失敗了，可以考慮用稀釋的方法，控制終蛋白濃度小于0.1mg/ml，蠕動(dòng)泵滴入攪拌的稀釋液中，pH控制高的，如pH9-10，適當(dāng)加一些甘油和EDTA，DTT。

影響蛋白原核表達(dá)的因素很多，如蛋白的親水性、密碼子的稀有性、蛋白毒性等。如疏水性過(guò)強(qiáng)，就難以表達(dá)；稀有密碼子過(guò)多或多個(gè)稀有密碼子連在一起也難以表達(dá)。我以前也遇到過(guò)這種情況，首先要分析你的蛋白序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，看看是否存在這些影響因素。如果必須要表達(dá)全長(zhǎng)蛋白，像你這種情況難度就比較大，可以進(jìn)行密碼子的改造，或者更換載體，或者更換宿主菌?？茨阍囼?yàn)的目的，如果不需要表達(dá)全長(zhǎng)蛋白，如表達(dá)部分抗原性強(qiáng)的片段，可以簡(jiǎn)單一點(diǎn)，表達(dá)部分片段即可。