組蛋白甲基化研究與表觀調(diào)控是腫瘤機(jī)制研究中的重要方向，然而傳統(tǒng)甲基化研究一般分四步走：尋找甲基化位點(diǎn)、分析甲基化位點(diǎn)與生物表型相關(guān)性、驗(yàn)證甲基化調(diào)控靶基因表達(dá)量變化、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控機(jī)制。

為更深入探索表觀調(diào)控與臨床現(xiàn)象間的具體機(jī)制，上海華盈生物合作伙伴 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院馬丁院士課題組以高分化惡性卵巢癌（HG-SOC）對(duì)順鉑耐藥為研究對(duì)象，為組蛋白甲基化和表觀調(diào)控提供了新的研究典范，相關(guān)研究成果近期發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》上。

文獻(xiàn)解讀

1、組蛋白甲基化，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因C/EBP

在HG-SOC組織中，研究人員應(yīng)用ChIP-seq技術(shù)對(duì)H3K4、H3K36、H3K79（轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)）和H3K9、H3K27、H4K20（轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)）六個(gè)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行基因?qū)用娴姆治?，結(jié)果顯示HG-SOC中許多基因的H3K79甲基化上調(diào)，并在IHC實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。RNA-seq結(jié)果表明HG-SOC中上調(diào)的基因與H3K79高甲基化相關(guān)，說(shuō)明H3K79甲基化對(duì)于調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮重要作用。

進(jìn)一步，利用生信軟件HOMER，研究人員找到與組蛋白甲基化相關(guān)的35個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中CEBPB（編碼C/EBP 蛋白）與H3K79甲基化上調(diào)成最顯著相關(guān)性，見(jiàn)圖1。
 

圖1 HG-SOC表觀遺傳重編程轉(zhuǎn)錄因子

 
2、C/EBP 高表達(dá)促進(jìn)卵巢癌對(duì)順鉑耐藥

目前卵巢癌患者在臨床治療中遇到的主要障礙是耐藥性，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。而C/EBP 在不良預(yù)后病人中高表達(dá)，因此研究人員推測(cè)C/EBP 與卵巢癌對(duì)順鉑耐藥相關(guān)。

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和IHC實(shí)驗(yàn)，對(duì)C/EBP 和卵巢癌病人的順鉑耐藥可能性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示高表達(dá)的C/EBP 與順鉑耐藥正相關(guān)。應(yīng)用C/EBP 基因過(guò)表達(dá)和敲降技術(shù)，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同步證實(shí)：C/EBP 過(guò)表達(dá)促進(jìn)順鉑耐藥，而敲降C/EBP 可以降低順鉑耐藥。此外，臨床卵巢癌患者在順鉑治療后，腫瘤組織中的C/EBP 蛋白表達(dá)水平也有明顯上調(diào)，如圖2。

圖2 C/EBP 與順鉑抗性分析

 
3、C/EBP 與H3K79的甲基化調(diào)控

根據(jù)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降C/EBP 可以導(dǎo)致H3K79甲基化水平下調(diào)，進(jìn)而可導(dǎo)致H3K79調(diào)控基因表達(dá)下調(diào)。研究人員在兩種不同的卵巢癌細(xì)胞系中分別敲降C/EBP 并檢測(cè)H3K79的甲基化水平。通過(guò)RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)C/EBP 敲降后，1238個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，504個(gè)基因發(fā)生下調(diào)，其中9個(gè)與順鉑抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平伴隨著H3K79甲基化的下調(diào)而降低。IPA分析顯示這些基因主要參與到順鉑抗性相關(guān)的DNA損失修復(fù)（DDR）信號(hào)和ERK5信號(hào)中，如圖3。

圖3 C/EBP 調(diào)節(jié)H3K79甲基化重編程基因表達(dá)

 
4. 發(fā)現(xiàn)C/EBP 調(diào)控H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L

根據(jù)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C/EBP 靶向基因與DOT1L靶向基因具有顯著相關(guān)性，并且C/EBP 結(jié)合位點(diǎn)與DOT1L結(jié)合位點(diǎn)距離接近，兩者有物理相互作用。經(jīng)過(guò)ChIP-qPCR驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，C/EBP 通過(guò)增強(qiáng)DOT1L結(jié)合能力調(diào)節(jié)H3K79甲基化。應(yīng)用DOT1L抑制劑或shRNA進(jìn)行體內(nèi)外抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DOT1L抑制后，C/EBP 高表達(dá)引起的順鉑耐藥性也隨之降低，見(jiàn)圖4。
 

圖4 C/EBP 通過(guò)DOT1L調(diào)節(jié)H3K79甲基化

 
5、蛋白芯片：搭建甲基轉(zhuǎn)移酶與耐藥現(xiàn)象的橋梁

對(duì)于大多數(shù)甲基化研究者來(lái)說(shuō)，能找到發(fā)揮顯著生物功能的甲基轉(zhuǎn)移酶已實(shí)屬不易。甲基化作為表觀調(diào)控的經(jīng)典方式，對(duì)生物表型的調(diào)控一般是通過(guò)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。然而，靶基因mRNA的表達(dá)與生物表型間還存在著巨大的gap。如何迅速在找到能夠承接甲基轉(zhuǎn)移酶與生物表型間的蛋白或蛋白修飾功能分子？蛋白芯片技術(shù)可以完美對(duì)接...
 在本研究中，為進(jìn)一步探討C/EBP -DOT1L引起順鉑耐藥的詳細(xì)機(jī)制，研究人員檢測(cè)DOT1L敲降后的23個(gè)C/EBP -DOT1L共調(diào)控靶基因，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)均降低。而這其中就包括已證實(shí)的信號(hào)通路調(diào)控分子RICTOR (AKT-mTOR)、SLC38A1(AKT)、OSMR(STAT3)、LDLR(ERK)和HIF1A(EGFR)等。如果能夠證實(shí)EGFR、PI3K-AKT、JAK-STAT3、ERK等信號(hào)通路同步也受到抑制，C/EBP -DOT1L表觀調(diào)控與卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的機(jī)理就得以完美解釋。
 面對(duì)復(fù)雜的信號(hào)通路篩選，研究人員果斷采用信號(hào)通路磷酸化廣譜芯片PCS248（一次芯片實(shí)驗(yàn)即可完成12條信號(hào)通路磷酸化調(diào)變篩選），對(duì)C/EBP 敲降組和對(duì)照組JAK-STAT、PI3K-AKT、MAPK等12條腫瘤通路進(jìn)行廣泛分析，快速證實(shí)了自己提出的假說(shuō)，為C/EBP -DOT1L促順鉑耐藥機(jī)理的探索畫(huà)上完美句號(hào)，即C/EBP 與DOT1L形成復(fù)合物調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)通路的活化導(dǎo)致臨床常用化療藥物順鉑在卵巢癌的治療過(guò)程中發(fā)生耐藥，見(jiàn)圖5。 

圖5 C/EBP 引起順鉑抗性信號(hào)機(jī)制

小結(jié)：

該研究采用了經(jīng)典的甲基化研究思路，找到了甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物C/EBP -DOT1L在卵巢癌順鉑耐藥中發(fā)揮作用，通過(guò)蛋白芯片技術(shù)揭開(kāi)了表觀調(diào)控與腫瘤耐藥之間的黑匣子，找到了明確的耐藥機(jī)制，為甲基化調(diào)控深入研究提供了典范。

 
英文文獻(xiàn)鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=C%2FEBP%CE%B2+enhances+platinum+resistance