數(shù)字PCR | 基于EVAGREEN 方法的CRYSTAL數(shù)字PCR絕對定量檢測 點擊次數(shù)：16 發(fā)布日期：2019-5-20 來源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負
基于EVAGREEN 方法的CRYSTAL數(shù)字PCR絕對定量檢測
EvaGreen 是一種無致突變性、無細胞毒性的DNA結(jié)合染料，NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)可兼容EvaGreen 染料進行的數(shù)字PCR實驗分析。
反應體系中游離的的EvaGreen 染料不發(fā)出熒光信號，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后會發(fā)出很強的熒光。NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)使用檢測參比熒光（熒光素鈉鹽）相同的濾光片可進行EvaGreen 染料熒光信號的檢測。
使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)，EvaGreen 可以通過使用簡單的引物來實現(xiàn)靶標絕對定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen 的方法可檢測低至0.2copies/ L。

圖1：基于EvaGreen 染料方法的基因組DNA絕對定量

對未進行片段化的人基因組DNA進行倍比稀釋，濃度范圍從1000-0.2copies/ L，使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen ，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重復性和穩(wěn)定性我們進行了三次重復（R2= 0.9977）。在NTC（無模板對照）孔中沒有觀察到陽性微滴。
EVAGREEN 核酸絕對定量實驗的建立
當使用EvaGreen 方法進行數(shù)字PCR實驗時，需要注意，加入PCR mix的模板dsDNA濃度過高將導致較高的背景熒光。此外，EvaGreen 染料與dsDNA具有較高的親和力，但同時也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力，導致背景熒光的增加。 
根據(jù)您所需定量的DNA類型和數(shù)字PCR反應體系，需要預估實際的動態(tài)范圍。有關(guān)如何建立EvaGreen 實驗的更多信息，可登錄我們網(wǎng)站 http://stillatechnologies.com。

圖2：EvaGreen 絕對定量散點圖

對未片段化的人類的基因組DNA進行倍比稀釋后，濃度范圍1000-0.2copies/ L，使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen ，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。

灰色點：陰性微滴，藍色點：陽性微滴。

RFU：相對熒光強度。

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