第二屆電鏡網(wǎng)絡(luò)會議(iCEM 2016)特邀報告

高壓快速冷凍電鏡固定技術(shù)及在生命科學中的應用

趙善廷 教授

西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院

報告摘要：

　　電鏡技術(shù)在生命科學中的應用已有六十多年的歷史，為生命科學在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的研究帶來了一場革命，突觸(synapse)的發(fā)現(xiàn)就是一個典型的例子，它結(jié)束了自十九世紀末至二十世紀五十年代近半個世紀有關(guān)神經(jīng)元之間是否有直接聯(lián)系的神經(jīng)生物學世紀之爭。

　　生命科學常規(guī)電鏡技術(shù)需要先用甲醛、戊二醛等化學試劑對樣品進行化學固定，但化學固定有以下三個方面的缺點，一是固定過程至少需要數(shù)分鐘，而機體內(nèi)的許多生理過程都非常短暫，僅持續(xù)數(shù)秒甚至毫秒，如神經(jīng)元突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，用傳統(tǒng)化學固定方法無法撲捉到這些生理過程的形態(tài)學變化和特征，而且植物細胞有細胞壁，昆蟲如線蟲等體表有幾丁質(zhì)，化學固定劑很難滲透，嚴重影響固定的效果;二是包埋前需要用酒精等有機溶劑對樣品進行脫水，這一過程會造成細胞和組織皺縮，使其形態(tài)和大小發(fā)生改變;三是化學固定劑特別是戊二醛可引起蛋白質(zhì)變性，造成蛋白質(zhì)抗原特性改變，使其與相應抗體的結(jié)合能力下降甚至喪失，導致電鏡免疫組化染色失敗。

　　為克服化學固定以上缺點，科學家發(fā)明了一種新的物理性電鏡固定技術(shù)，稱為高壓快速冷凍電鏡固定技術(shù)，利用該技術(shù)可以在不使用任何化學固定劑的條件下在五十毫秒之內(nèi)將組織和細胞完全固定，然后既可通過常規(guī)電鏡包埋和超薄切片后進行超微結(jié)構(gòu)觀察和研究，也可通過冰凍替代技術(shù)包埋和切片后進行包埋后免疫膠體金染色(post-labeling)，對蛋白質(zhì)進行超微結(jié)構(gòu)下的定位定量研究。

　　雖然高壓快速冷凍固定技術(shù)克服了化學固定的三大缺點，但它本身也有一個缺點，即固定的樣品非常小，直徑不能超過1毫米，厚度不能超過200微米，限制了它在神經(jīng)生物學研究中的應用。為了克服高壓冷凍固定技術(shù)的缺點，將其應用到神經(jīng)生物學研究中，趙善廷教授與該技術(shù)的發(fā)明者Studer博士合作，將器官型腦片培養(yǎng)技術(shù)(organotypic slice culture)和高壓快速冷凍固定技術(shù)相結(jié)合，成功地研究了與學習和記憶密切有關(guān)的長時程效應(long-term potentiation, LTP)對突觸的影響。

　　結(jié)果顯示與化學固定相比高壓冷凍固定后細胞和組織的超微結(jié)構(gòu)更加清晰完整，LTP十分鐘后突觸小泡的數(shù)量明顯下降，突觸結(jié)構(gòu)明顯改變。結(jié)合包埋后免疫膠體金技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)高壓冷凍固定可明顯提高膠體金標記的陽性率和特異性。因此，高壓快速冷凍電鏡技術(shù)為研究突觸小泡遞質(zhì)釋放和再循環(huán)機制及相關(guān)蛋白在突觸上的超微結(jié)構(gòu)定位和定量等神經(jīng)生物學方面的研究提供了有利條件。

　　參考文獻：

　　1， Studer D*, Zhao S*(equally contributed), Chai X, Jonas Peter, Graber W , Nestel S, Frotscher M. Capture of activity-induced ultrastructural changes at synapses by high-pressure freezing of brain tissue. Nature Protocols. 2014;9(6):1480-95.

　　2，Zhao S, Studer D, Chai X, Graber W, Brose N, Nestel S, Young C, Rodriguez EP, Saetzler K, Frotscher M. Structural plasticity of hippocampal mossy fiber synapses as revealed by high-pressure freezing. J Comp Neurol. 2012;520(11):2340-5.

報告人簡介：

　　趙善廷，西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院“后稷學者”特聘教授，博士生導師，陜西省“百人計劃”入選者，德國漢堡大學客座研究員。

　　主要學習經(jīng)歷

　　1980.9-1985.7： 濱州醫(yī)學院，臨床醫(yī)學專業(yè)，獲學士學位

　　1985.9-1988.7： 新疆醫(yī)科大學，組織胚胎學專業(yè)，獲碩士學位

　　1998.10-2001.1：德國Freiburg大學醫(yī)學院, 解剖研究所，獲醫(yī)學博士學位

　　2001.1-2004.9： 德國Freiburg大學醫(yī)學院, 解剖研究所，博士后

　　主要工作經(jīng)歷

　　1988.8-1998.9： 新疆醫(yī)科大學，組織胚胎學教研室，助教，講師，副教授

　　1997.5-1998.4： 德國Freiburg大學醫(yī)學院，解剖研究所，訪問學者

　　2004.10-2010.12：德國Freiburg大學醫(yī)學院，解剖研究所，助理教授

　　2008.12-2011.3：蘭州大學生命科學學院，“萃英學者”特聘教授，博士生導師

　　2011.1-至今：西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院“后稷學者”特聘教授，博導，

　　陜西省“百人計劃”入選者，德國漢堡大學客座研究員

　　工作簡介

　　在德國Freiburg大學醫(yī)學院，趙善廷主要以子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染、器官型腦片培養(yǎng)、熒光免疫組化、電鏡、激光共聚焦顯微鏡等形態(tài)學技術(shù)和原位雜交、Western-blot等分子生物學技術(shù)對大腦發(fā)育，成體神經(jīng)干細胞及突觸可塑性與學習和記憶的機制等神經(jīng)生物學熱點問題進行了深入和細致的研究。

　　回國后，在繼續(xù)進行以上研究方向的基礎(chǔ)上，趙善廷開展了環(huán)境和疫病對動物和家畜神經(jīng)系統(tǒng)的影響、應激和動物福利對畜禽免疫力和健康養(yǎng)殖的影響及與食品安全的關(guān)系、中藥對神經(jīng)系統(tǒng)的影響及對老年性疾病的預防和治療等方面的研究。先后發(fā)表學術(shù)論文90余篇，其中在“Nature”子刊、“Journal of Neuroscience”、“Development”等國際著名學術(shù)雜志上發(fā)表SCI論文53篇，累積影響因子超過250，其中17篇影響因子在5以上，一篇影響因子高達31.7 。

　　自2002年以來作為主要人員參與德國及歐共體重大科研項目4項(相當于中國973項目)，并主持一項子課題。回國后主持2項國家自然科學基金面上項目和2項省部級項目。

報告時間：2016年10月26日上午