蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)具體操作步驟

? ?蛋白質(zhì)印跡免疫分析的過程包括蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后，在電場(chǎng)作用下將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后再用抗待檢蛋白質(zhì)的抗體 作為探針與之結(jié)合，經(jīng)洗滌后，再將濾膜與二級(jí)試劑-放射性標(biāo)記的或辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶 偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體 結(jié)合，進(jìn)一步洗滌后，通過放射自顯影或原位酶反應(yīng)來確定抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物在濾膜上的位置和豐度。

??? 【蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)所需試劑】

??? 1.IgG 標(biāo)準(zhǔn)品

??? 2.羊抗人辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG 抗體

??? 3.轉(zhuǎn)移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱貯存。

??? 4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl調(diào)至pH7.5,然后補(bǔ)加三蒸水至1000ml.

??? 5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul.

??? 6.封閉液：5%脫脂奶粉。

??? 7.抗體buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS.

??? 8.顯色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基聯(lián)苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 檸檬酸buffer（0.01mol/L 檸檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10

??? μl（臨用時(shí)現(xiàn)配）。

??? 9.脫色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸餾 水至1000ml.

??? 10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脫色液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，濾紙 過濾。

??? 【蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)操作步驟】

??? 一、樣品的SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳

??? 按實(shí)驗(yàn)四操作步驟進(jìn)行。加樣時(shí)，注意在同一塊膠上按順序做一份重復(fù)點(diǎn)樣，以備電泳結(jié)束時(shí)，一份用于免疫鑒定，一份用于蛋白染色顯帶，以利相互對(duì)比，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

??? 二、轉(zhuǎn)移印跡

??? 1.轉(zhuǎn)移前準(zhǔn)備：將濾紙，硝酸纖維素膜（NC）剪成與膠同樣大小，NC膜浸入蒸餾 水中 10-20min 后浸入轉(zhuǎn)移buffer中平衡30min .

??? 2.凝膠平衡：將電泳后的SDS -PAGE膠板置于轉(zhuǎn)移buffer 中平衡 30-60min.

??? 3.按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。

??? 4.開始轉(zhuǎn)移，連接正負(fù)極，蓋好蓋子，接上電源，恒流 0.8mA/cm,室溫下轉(zhuǎn)移1h,轉(zhuǎn)移后的凝膠再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脫色檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。

??? 三、免疫染色

??? 1.轉(zhuǎn)移后的NC膜于5%脫脂奶粉中封閉，4℃過夜。

??? 2.TBS洗膜1-2次，10min/次。

??? 3.加HRP標(biāo)記的抗體，室溫1h .

??? 4.TBS 洗3次，10min/次。

??? 5.NC膜再轉(zhuǎn)入DAB顯色液中，置暗處反應(yīng)，待顯色反應(yīng)達(dá)到最佳程度時(shí)，立即用三蒸水洗滌終止反應(yīng)。