生物物理工具熒光顯微鏡技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用

  免疫熒光技術(shù)不僅可以獲得定性和半定量的數(shù)據(jù)，而幾也
是一種用來對細(xì)胞內(nèi)某組分進(jìn)行準(zhǔn)確定量的很敏感的方法。無
論是從普通顯微鏡還是從共聚焦顯微鏡獲得的熒光影像均可進(jìn)
行數(shù)字化，然后在計算機(jī)上用圖像分析軟件處理。電子圖像的
獲得和分析是一個發(fā)展很快的領(lǐng)域，
。熒光顯微鏡技術(shù)具有較高靈敏性和專一性，因此是直接由
于研究活細(xì)胞內(nèi)特定組分的極難得的生物物理工具。

抗體
免疫熒光法要求杭體必須能夠在其他分子濃度很高時專一
地識別抗原分子。在多克隆抗血清中因含有多種不同的抗體，
它們可以與同一種抗原的多個抗原決定部位結(jié)合，因此，多克
隆抗血清雖然通常能很好地染色細(xì)胞，但是常常存在著高濃度
的非專一性抗體，因此會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景。在多數(shù)情況下，抗
血清的簡單滴定使偽信號減低到檢測水平以下，從而消除這一
問題?？寡宓男盘枏?qiáng)度是直接地依賴于抗休的濃度并和抗休
的親和常數(shù)有關(guān):親和性越強(qiáng)，有效稀釋度越高。如果滴定不
足，在使用前，以固定的細(xì)胞預(yù)吸附抗血清，事實(shí)上，稀釋數(shù)
倍后也可以獲得較清楚的信號。除此之外另一個常用于多克隆
抗體的方法是抗體的免疫親和純化，也可以降低非專一性的染
色

  或者組織培養(yǎng)的上清液和腹水或者兩者的混合物都可以使
用作為單克隆抗體，由于一般認(rèn)為單一抗體是在沒有競爭的情
況下與抗原結(jié)合的，因此總的說來使用單抗會增強(qiáng)信號強(qiáng)度，
雖然單克隆抗體通常能給出清晰的信號，但是某些單克隆抗體
在細(xì)胞染色時卻不呈反應(yīng)，這可能是由于下列事實(shí)所造成的，
即細(xì)胞中的特異性抗原決定簇被掩蓋了或者是在細(xì)胞固定期間
被破壞之故。