2020年注定是不平凡的一年，而在每個平凡工作崗位上的我們，總希望能在這個特殊的時期做點什么，哪怕微小的貢獻，匯集在一起，一定會成為改變的推動力。

所以，小編梳理了一下在抗病毒藥物、疫苗研發(fā)生產等相關領域的工作中，我們的微孔板檢測及成像設備能夠開展的實驗和項目，希望能夠對在攻堅崗位上奮斗的老師們有所幫助。

病毒，可以是惡魔，也可以是工具

我們都知道，病毒（virus)由一種核酸分子（dna或rna）與蛋白質（protein）構成或僅由蛋白質構成（如朊病毒）的有機形態(tài)，它介于生命與非生命之間，超然在五界之外（傳統(tǒng)的五界分類法）。
這樣一種看起來無比“簡單而低級”的東西，卻在人類歷史上留下持續(xù)至今揮之不去的陰影，比如ebola，比如hiv，比如，現(xiàn)在全國上下一心對抗的新冠病毒。但是，擁有高級智慧的人類，怎會輕易被這些簡單而低級的玩意兒打??？所以，我們有了疫苗，有了抗病毒藥物，聰明的人類還利用病毒感染宿主細胞進行自我復制的機制，把惡魔變成工具，應用到人類的生產生活中，比如通過病毒進行花卉育種，利用病毒作為載體進行生物研究、基因治療等等。所以今天，我們首先分享一些圍繞抗病毒藥物研發(fā)、疫苗生產等相關領域，微孔板檢測和成像設備的應用方向，后續(xù)我們會為大家繼續(xù)分享微孔板相關設備在如何“利用”病毒開展生物研究工作。

病毒的數(shù)量與感染性測定

病毒感染哺乳動物細胞后，除了通過rt-pcr的方法，可以通過細胞病變效應、紅細胞吸附和免疫標記檢查法等評價病毒在細胞中的增殖情況。細胞病變效應（cytopathic effect, cpe），是指病毒在敏感細胞內增殖引起的光鏡下可見的細胞病理改變。大多數(shù)動物病毒感染敏感細胞培養(yǎng)都能引起其顯微表現(xiàn)改變，例如細胞聚集成團腫大圓縮脫落及細胞融合成為多核細胞，細胞內出現(xiàn)包涵體（inclusion body），乃至細胞裂解等，正是因為cpe的表現(xiàn)，我們可以在體外細胞水平評價病毒感染宿主細胞的情況。病毒毒價測定是病毒學相關研究中最基本的技術手段，無論疫苗研發(fā)、抗病毒藥物評估或者是病毒重組載體構建，均需要在不同環(huán)節(jié)評定病毒毒價，而目前主要方法包括蝕斑實驗、tcid50測定和免疫染色法等。

病毒蝕斑實驗

病毒蝕斑是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。方法：將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位 (plaque forming  unit,pfu)。通常以每毫升病毒液的空斑形成單位既 pfu/ml表示。



上圖來自武漢大學基礎醫(yī)學院，病毒感染6孔板細胞后形成空斑病灶，使用中性紅染色后，通過cytation的4x物鏡明場模式對全孔進行拼接成像，軟件分析識別孔中的空斑病灶個數(shù)。

tcid50法

tcid50法是測定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細胞發(fā)生感染的最小量。方法：一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經一定時間后觀察cpe、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞的量為終點。最后用統(tǒng)計方法（reed muench法）計算出50%組織細胞感染量（ 50%tissue culture  infectious  dose,tcid50)。

免疫染色法

空斑實驗法或常規(guī)tcid50測定滴度依賴于病毒在感染細胞中的復制以及感染周邊細胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細胞并表達病毒所編碼的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or ifu/ml）測定病毒滴度需要的時間比空斑法（pfu/ml）更短。其中，免疫染色法包括hrp組化或免疫熒光染色等。同樣類型方法也適用于表達熒光報告基因的重組病毒的毒價測定。例如，以針對桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體標記被病毒感染的細胞，然后以hrp-標記的二抗與感染細胞進行染色。通過底物顯色，在光學顯微鏡下計數(shù)感染斑點的數(shù)量，經過稀釋倍數(shù)的換算，即可得出病毒的滴度（ifu/ml）。

輸

問題：無論是plaque assays還是tcid50，均涉及較多微孔的細胞計數(shù)或陰/陽性孔判斷，常規(guī)的顯微鏡觀測法，操作不便且對研究者傷害較大。因此biotek為大家提供了更加自動化的解決方法：通過cytation/lionheartfx自動化成像設備進行cpe或者plaque的成像及計數(shù)。

上圖：cytation5自動化成像系統(tǒng)支持明場、彩色明場、熒光場等模式自動化成像檢測，并且可選擇大視野成像模式，4倍鏡一個視野可覆蓋384孔板整孔，提高全孔、整板成像的檢測速度。




上圖：兩種病毒感染細胞后，通過紅色/綠色熒光探針標記的抗體進行免疫熒光染色，采用cytation雙熒光通道自動成像，并對病毒感染的細胞病灶進行識別成像。



上圖：對24孔板進行自動成像，并且定量分析每孔內的病灶個數(shù)。無論是cytation系列還是lionheart系列，均能對6-384孔板進行多通道整孔成像，極大減少了人工識別cpe及plaque的工作。

疫苗研發(fā)生產中的應用

疫苗效力評價最有效的方法是中和抗體水平檢測及中和抗體活力評價。

普通病毒疫苗效果的評價，可以通過收集減毒或滅活病毒疫苗免疫后人或動物血清，與自然源性病毒進行中和抑制試驗，以檢測中和抗體效價及中和抗體活力。

中和抗體的原理是抗體與相應的病毒粒子特異性結合，使病毒喪失感染細胞的能力，一般采用的是固定病毒—稀釋血清法。

固定病毒—稀釋血清法

將不同稀釋度的血清與固定量的病毒（200tcid50、eid50或ld50）混合，一般37 條件下感作一定時間以后（通常為1h），再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或實驗動物，每一稀釋度接種3～6只（個、管）試驗動物(或雞胚、細胞)，記錄每組樣品的動物死亡數(shù)、累積死亡數(shù)和累積存活數(shù)，按此前提到的reed-muench法或karber法計算其半數(shù)保護量（pd50），即該血清的50%中和效價(pd50)。

可見，對于抗病毒疫苗中和抗體的測定方法中，最終的檢測指標也可以用cpe計數(shù)、或熒光標記的病毒灶來評估，而完整的中和抗體檢測需要測定大量的細胞樣本，通常要對整板96孔板的整孔進行觀測。這樣的應用中，biotek能夠建立標準化的實驗方案流程，樣品的拍攝、病灶的分析計數(shù)到結果的輸出可以自動完成：

上圖：cytation對96孔板內的熒光標記的病毒灶進行全孔、整板成像。




上圖：通過圖像分析評價不同濃度的免疫血清抑制病毒感染細胞的能力，pos表示該孔內有病毒病灶形成，neo表示改孔無病灶。根據此結果，后續(xù)可計算pd50。

抗病毒藥物篩選相關應用

針對不同種類的病毒，科學家們的前期工作已經積累了較多的篩選策略，比如，對于目前來勢洶洶的冠狀病毒，在抗擊sars及mers的經驗中對于此類cov新藥的主要靶點可以圍繞cov表面結構的棘突糖蛋白、靶向宿主受體的單克隆抗體、進入途徑有關的宿主蛋白酶抑制劑、以cov復制結構基因為靶點的sirnas等（zumla a, nature reviews drug discovery, 2016, 15(5): 327.。

對于hiv等逆轉錄病毒，研發(fā)策略可傾向于受體拮抗劑、整合酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑這些方向；對于hcv病毒可采用rna復制酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等（nature reviews drug discovery 6, 1001-1018）。

基于微孔板的高通量及高內涵篩選平臺為以上策略提供了靈活的解決方案，比如下面這篇文章，可以為大家提供一些基于微孔板篩選抗病毒藥物的思路，

文中選擇的靶點是ns3解旋酶，hcv解旋酶是一種蛋白酶，位于病毒多功能非結構蛋白3 (ns3)的c端三分之二。因此，抑制解旋酶可作為抗生素或抗病毒藥物。

構建hcv ns3h（ns3 lacking the protease domain），使用dna寡核苷酸序列代替rna序列，通過fp、htrf和alphascreen篩選能夠抑制ns3-dna復合體形成的化合物。這是一種比較新穎的思路，采用抑制dna復合物的方法來篩選hcv解旋酶抑制劑。所用的化合物庫來自sigma’s library of pharmacologically active compounds (lopac)。

上圖展示了基于熒光偏振的篩選思路以及得到的4個候選化合物劑量效應曲線。

文章展示了使用多功能微孔板檢測設備在篩選hcv抗病毒藥物的有效性，并且表明其采用的這三種方法均是較為成熟的商品化方案，篇幅所限，感興趣的老師可以在原文中閱讀其他方法的篩選結果和思路。

biotek為大家提供的synergyneo2是頂尖的微孔板藥物篩選平臺，能夠快速高效的實現(xiàn)以上的熒光分子互作的篩選技術平臺。

上圖：synergyneo2高通量微孔板檢測儀能夠提供高速、高效的trf、fp、htrf、alphascreen技術檢測平臺。除了采用分子互作技術針對性的開展基于靶點的篩選，也可以采用基于表型的方法，例如cpe病灶改變、細胞活力等進行快速化合物篩選，這里就不一一贅述了。

病毒的臨床診斷

病毒臨床診斷方面的應用主要集中在免疫學檢測，通過測定患者血液樣本中的病毒抗體或表面抗原的含量判斷是否存在病毒感染。比如hbv表面抗原（hbsag）是病毒外膜的主要組成蛋白，一直是hbv感染最重要的血清學檢測指標，也是最直接的病原學證據之一。目前針對hbv, hcv, hiv等多種病毒均有臨床可用的商品化解決方案，除了常見的吸收光elisa測定，也有諸多試劑開發(fā)團隊研發(fā)了靈敏度更高，檢測更為便捷的時間分辨熒光免疫檢測法，即trfia技術。

輸

值得一提的是，當下新冠狀病毒2019-ncov的臨床診斷雖然主要依賴核酸檢測，但是由于核酸檢測的取樣位置、患者的免疫狀態(tài)等原因，單純依靠熒光定量pcr的核酸檢測有一定的局限性。目前，已經有試劑公司開發(fā)出針對新冠狀病毒的igm和igg抗體檢測elisa試劑盒，能夠為臨床提供血清學診斷輔助證據，可聯(lián)合核酸檢測方法進行使用。

biotek的synergyh1多功能微孔板檢測儀擁有中華人民共和國醫(yī)療器械注冊證，能夠為一線臨床診斷崗位的醫(yī)療工作者提供精準的基于吸收光、熒光、發(fā)光、時間分辨熒光及熒光偏振的免疫檢測結果。

上圖：synergyh1多功能微孔板檢測儀，能夠支持elisa、trfia、lia等多種模式的免疫檢測。

在這場人類和病毒曠日持久的戰(zhàn)“疫”中，相信會有越來越多的檢測手段迅速發(fā)現(xiàn)病毒，也會有更新的，更具針對性的藥物和治療方案也會相繼出現(xiàn)，我們能做的，就是堅守好自己的崗位，持續(xù)為大家提供堅實的硬件和技術保障。心系武漢湖北加油!