2018/11/2 15:43:53 閱讀(44)

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase ）活性酶耦聯(lián)光度法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦聯(lián)光度法定量檢測試劑是一種旨在通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析植物裂解樣品中 PEPCase 活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等、部分或完全純化酶樣品中 PEPCase 的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate Carboxylase；PEPCase；EC4.1.1.31），屬于羧基裂解酶（carboxylyase）家屬成員之一，同源四聚體，單體110Kd，廣泛存在于植物、原生生物（protist）和細(xì)菌里，位于胞漿，催化碳酸氫固定（bicarbonate fixation）到磷酸烯醇式丙酮酸，產(chǎn)生四碳化合物草酰乙酸，釋放磷酸根的反應(yīng)。在四碳（C4）和景天酸代謝（crassulacean acid metabolism；CAM）等陸生植物（terrestrialplant）中，例如玉米等，其具有催化光合成碳同化作用（assimilation）和有機酸代謝，控制 -羧基化（ -carboxylation）的效率，產(chǎn)生NADPH，調(diào)節(jié)pH和電中性（electroneutrality），生成蘋果酸以及酵解，重新捕獲呼吸產(chǎn)生的二氧化碳等功能；在三碳（C3）或非光合成和四碳類植物中，例如水稻和小麥等，其參與回補反應(yīng)（anaplerotic），為KREBS循環(huán)提供中間產(chǎn)物，并且提供碳類支持氨基酸合成，尤其在植物發(fā)育和種子發(fā)芽時期，調(diào)節(jié)碳和氮代謝相互作用?；诘孜锪姿嵯┐际奖幔诙趸嫉拇嬖谙?，受到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用，獲得產(chǎn)物草酸乙酰（oxaloacetate），進而通過蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase；MDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（ReagentA） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

酶促液（Reagent D） 微升

反應(yīng)液（Reagent E） 微升

底物液（Reagent F） 微升

陰性液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說明書 1 份

保存方式保存清理液（ReagentA）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

（微型）臺式離心機：用于樣品預(yù)處理

200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定 1 克組織重量

2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入 xx 毫升 清理液（Reagent A ）清洗 1 次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的 xx 毫升 裂解液 （Reagent B ）

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放進預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約 80 下）

9． 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管，放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

10．小心移出上清液（注意： 不要觸碰沉淀物 ）到 1.5 毫升離心管

11．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ GMS30030.1）

12．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C ）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 陰性液（Reagent G ）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（注意：50 微克植物裂解蛋白；樣品須溶解 ）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

五、 計算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀 測定

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到 96 孔板里

3． 分別加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

4． 分別加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

5． 分別加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

6． 輕輕搖動 96 孔板

7． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 xx 微升 陰性液（Reagent G ）或待測樣品（50 微克植物裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈 ）

9． 輕輕搖動 96 孔板

10．即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11．活性計算：

注意事項

1． 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 加入樣品啟動反應(yīng)后 3 秒內(nèi)即刻光度測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 30 分鐘

8． 光度測定后，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 8.0 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13．本公司提供系列羧化酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

秉著 信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾 的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN T WORK， ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHATYOU DID WRONG 。

訂購信息

單組分訂購信息

編號 名稱 規(guī)格

GMS16017 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性酶耦聯(lián)光度法定量檢測試劑盒 20 次

GMS16017A 清理液（ReagentA） 毫升

GMS16017B 裂解液（Reagent B） 毫升

GMS16017C 緩沖液（Reagent C） 毫升

GMS16017D 酶促液（Reagent D） 毫升

GMS16017E 反應(yīng)液（Reagent E） 毫升

GMS16017F 底物液（Reagent F） 毫升

GMS16017G 陰性液（Reagent G） 毫升