免疫學(xué)的發(fā)展史起始于微生物學(xué)研究，于18世紀(jì)建立，19 世紀(jì)至 20 世紀(jì)中期進(jìn)入經(jīng)典發(fā)展期。這一時(shí)期，人們對(duì)免疫功能的認(rèn)識(shí)由人體現(xiàn)象的觀察進(jìn)入了科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)期。20世紀(jì)初期到中期，進(jìn)入近代免疫學(xué)時(shí)期。從20世紀(jì)中期開(kāi)始，真正進(jìn)入現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期?，F(xiàn)代免疫學(xué)的檢測(cè)基本歷經(jīng)了以下幾個(gè)過(guò)程，如圖1所示。

圖1.免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展史

免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。各類免疫學(xué)檢測(cè)方法的性質(zhì)及發(fā)展?fàn)顩r詳見(jiàn)表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位，但是從我國(guó)臨床免疫診斷現(xiàn)狀來(lái)看，其步伐都落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，亟待改進(jìn)。

 放射性免疫酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)靈敏度10-1510-1310-15- 10-1810-1710-21精密度（批間差）＞15%10%-15%＜10%-15%5%＜10%線性范圍105102106-7107107檢測(cè)時(shí)間3-4小時(shí)2-3小時(shí)65分鐘10分鐘18-40分鐘放射污染有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)操作手工手工/批量自動(dòng)化手工/全自動(dòng)全自動(dòng)全自動(dòng)有效期2個(gè)月6-12個(gè)月12個(gè)月12個(gè)月12個(gè)月定性/定量定量定性/半定量定量定量定量發(fā)展趨勢(shì)環(huán)境污染，國(guó)內(nèi)處于衰退期；歐美已經(jīng)完全淘汰。國(guó)內(nèi)處于成熟期；歐美處于衰退期。國(guó)內(nèi)處于導(dǎo)入期和成長(zhǎng)期；歐美處于成熟期?？墒褂庙?xiàng)目廣泛，羅氏技術(shù)。各項(xiàng)目可隨機(jī)組合使用，國(guó)內(nèi)處于發(fā)展期。

表1. 各類免疫檢測(cè)技術(shù)的性質(zhì)及優(yōu)缺點(diǎn)

化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子，對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而進(jìn)行定量分析（見(jiàn)圖2）?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常的定量分析方法。

 

圖2. 化學(xué)發(fā)光基本原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用CLIA測(cè)定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) ：
①高度敏感，極限達(dá)10-17－10-19mol/L，遠(yuǎn)高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng)，但比TRFIA便宜。
②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好CV＜10％。
③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。
④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期12月。
⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來(lái)的一種新興分析方法，其基本原理見(jiàn)圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動(dòng)化性，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。

圖3. 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)（雙抗夾心法）原理示意圖

目前磁微?；瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目。

 

能夠用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的磁珠種類

按材質(zhì)分：

材質(zhì)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)磁性瓊脂糖微球1. 親水性強(qiáng)，溫和的條件容易洗脫，不至于引起酶失活或蛋白質(zhì)變性
2. 表面惰性，非特異性吸附低，受pH影響小
3. 容量大，具有開(kāi)放性的支撐骨架
4. 組織相容性好1. 機(jī)械性能和力學(xué)性能較差
2. 溶脹程度會(huì)隨溶劑性質(zhì)變化磁性二氧化硅微球1. 機(jī)械強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)
2. 化學(xué)穩(wěn)定性較優(yōu)1. 硅膠自身結(jié)構(gòu)空隙較多，容易造成表面大量的水存積，增加了化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性
2. 堿性條件下非常不穩(wěn)定
3. 存在較大的非特異性吸附性磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸類高分子微球1. 具有較好的親水性
2. 良好的血液相容性
3. 與其他高分子化合物共聚，改善其力學(xué)性能和穩(wěn)定性收縮過(guò)大，易產(chǎn)生縮孔磁性聚苯乙烯微球1. 機(jī)械強(qiáng)度高
2. 表面易功能化
3. 表面非離子相互作用弱
4. 交聯(lián)聚苯乙烯能夠在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)
5. 微球粒徑大小可控聚苯乙烯微球表面為疏水性，對(duì)某些蛋白存在非特異性，需要對(duì)表面進(jìn)行功能化修飾

按照官能團(tuán)分：

磁珠種類常見(jiàn)活化方法配體的反應(yīng)位點(diǎn)羥基磁珠CDI活化、溴化氰氨基羧基磁珠EDC活化，NHS活化氨基氨基磁珠戊二醛活化氨基環(huán)氧基磁珠 巰基、氨基NHS磁珠 氨基SA磁珠配體生物素標(biāo)記生物素

 

海貍磁珠應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)機(jī)理

 

免疫吸附種類原理舉例磁性微球表面固定抗原將抗原固定在微球表面，吸附相應(yīng)的抗體和殘留有抗體活性的免疫復(fù)合物Mag COOH(70102) Mag NHS(70701)磁性微球表面固定抗體將抗體固定在微球表面，吸附相應(yīng)的抗原和殘留有抗原活性的免疫復(fù)合物Mag COOH(70102) Mag NHS(70701)磁性微球表面固定補(bǔ)體利用補(bǔ)體Clq與免疫復(fù)合物的Fc段結(jié)合吸附免疫復(fù)合物，如DNA-抗DNA抗體復(fù)合物_磁性微球表面固定蛋白A/G/L蛋白A/G/L固定在磁性微球表面，可吸附抗體和免疫復(fù)合物Mag protein A （22203） Magrsoe ProteinA/G（22202）疏水結(jié)合型磁珠表面為疏水性材質(zhì)，能夠與目標(biāo)生物分子疏水作用力結(jié)合磁珠表面具有疏水性配體，能夠與目標(biāo)生物分子共價(jià)作用力結(jié)合對(duì)甲苯磺?；胖?疏水蛋白 聚苯乙烯微球+磷酯類蛋白靜電結(jié)合型配體與被吸附物靠靜電作用而結(jié)合。磁性微球表面為帶陰離子基團(tuán)的甲基白蛋白，可靜電結(jié)合帶陽(yáng)離子基團(tuán)的DNA-抗DNA抗體復(fù)合物

 

磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法

間接法

間接法就是包被抗原，然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)樣本中抗體，基本原理見(jiàn)圖4，適合于檢測(cè)對(duì)象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)較方便，只要變換包被抗原就可以檢測(cè)不同的項(xiàng)目。間接法的缺點(diǎn)：標(biāo)本中的特異性抗體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗原，使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

圖4. 采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標(biāo)抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

捕獲法

血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定，因此測(cè)定IgM抗體多用捕獲法?；驹砣鐖D5所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測(cè)定特異性IgM。

圖5. 采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。
d)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。
e)加底物顯色，檢測(cè)信號(hào)。

固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法，是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)性的與磁珠表面抗原結(jié)合。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法基本原理如圖6所示。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無(wú)抗體，酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合，出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。若受檢樣本中有抗體，則競(jìng)爭(zhēng)性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合，酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱，信號(hào)強(qiáng)度減弱。

圖6. 采用固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

雙抗夾心（兩步法）

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，基本原理如圖7所示。

圖7. 采用雙抗夾心法（兩步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜。
b)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問(wèn)，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
c)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
d)加發(fā)光底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

雙抗夾心法（一步法）

在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果（如圖8， 雙抗夾心法及雙位點(diǎn)一步法。缺點(diǎn)：假陰性）

圖8. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

圖9. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，當(dāng)樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。

操作步驟：

a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

 

海貍產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

ling先的表面技術(shù)

蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，掌握先進(jìn)的生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質(zhì)的定向包被、充分表露蛋白的活性位點(diǎn)。生物納米表面技術(shù)成功將生物技術(shù)與納米技術(shù)融合，明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現(xiàn)象。通過(guò)近4年的技術(shù)沉淀，已經(jīng)申請(qǐng)相應(yīng)12篇。

海貍公司生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的定向性，以及活性位點(diǎn)的充分暴露。
左圖普通技術(shù)包被的磁珠，表面抗體呈現(xiàn)雜亂無(wú)章，保持5%-10%的抗體活性。
右圖海貍公司采用定向包被技術(shù)，保證抗體的活性端充分暴露，保持抗體100%的活性。

自主研發(fā)磁珠

作為國(guó)內(nèi)zui大、種類zui全的磁珠生產(chǎn)商之一，蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司以國(guó)際ling先的生物納米表面技術(shù)和生物試劑技術(shù)為核心，開(kāi)發(fā)了一系列生物醫(yī)用磁珠及試劑盒。其中，磁珠類產(chǎn)品線囊括了多個(gè)領(lǐng)域，包括特異性標(biāo)記與捕獲，蛋白快速分離與純化，核酸提取與文庫(kù)構(gòu)建，及高通量、自動(dòng)化生物樣本處理綜合技術(shù)平臺(tái)。目前，海貍公司已經(jīng)發(fā)展成為一家集自主研發(fā)、規(guī)?；a(chǎn)和于一體的生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域高科技企業(yè)。

海貍公司磁珠的微觀形貌

a）Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖，該磁珠的粒徑分布均一，為2微米。表面光滑，能夠降低部分非特異性吸附。
b）Mag NH2-500偶聯(lián)SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術(shù)包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被，且避免磁珠的粘連。
c）磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級(jí)磁核，填充于30-150 m的瓊脂糖微球內(nèi)，形成載量極高的微球。對(duì)抗體的結(jié)合量達(dá)30mg/mL磁性微球。
d）將Magrose NHS磁珠偶聯(lián)熒光蛋白后，在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布，且保證蛋白的利用效率。

 

海貍磁珠（BeaverBeads ）在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的應(yīng)用

可用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的磁珠，種類如前面第三章所列。但其中，鏈霉親和素磁珠的使用zui為廣泛，主要是因?yàn)橛H和素-生物素系統(tǒng)的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統(tǒng)（BAS）的主要特點(diǎn)如下列表。

靈敏度高生物素容易與蛋白質(zhì)和核酸類等生物大分子結(jié)合，并保持大分子物質(zhì)的原有生物活性。
每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物。
因此，BAS具有多級(jí)放大作用，使其在應(yīng)用時(shí)可極大地提高檢測(cè)方法的靈敏度。穩(wěn)定性好生物素與親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度zui高的非共價(jià)作用，親和常數(shù)（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬(wàn)倍。
二者的結(jié)合穩(wěn)定性好專一性強(qiáng)，不受試劑濃度，pH環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有機(jī)溶劑影響。特異性強(qiáng)親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性。而且，BAS結(jié)合特性不會(huì)因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，使其在實(shí)際應(yīng)用中可zui大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。普適性廣生物素-結(jié)合素系統(tǒng)的多功能性還能提供一套統(tǒng)一的研究方法，適合用于不同的項(xiàng)目體系。其他通用性強(qiáng)，可制成多種通用性試劑（如生物素化二抗）適用于不同的反應(yīng)體系。
生物素與親和素的結(jié)合具高速、的特性，盡管BAS的反應(yīng)層次較多，但所需的溫育時(shí)間很短。

海貍鏈霉親和素磁珠，是采用蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程納米表面技術(shù)，將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面，排列均勻，并朝向一致。產(chǎn)品具有較高的生物素結(jié)合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結(jié)合量高達(dá)800pmol以上，生物素化抗體結(jié)合量為20 g以上。

海貍鏈霉親和素磁珠化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，體現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，以及與進(jìn)口品牌磁珠相當(dāng)?shù)撵`敏性。

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)**項(xiàng)目Competitor D RLU-1RLU-2RLU-3AVECVRatio(S/0)S0170261703317804172882.6%/S1342033391136506348734.1%2.0S2532555340552721531270.7%1.5S31836571871461689841799295.4%3.4S47916648274817957088049512.4%4.5S520581232204629224823021703274.6%2.7S637778413635292365117636881032.1%1.7BeaverBeadsTMStreptavidin RLU-1RLU-2RLU-3AVECVRatio(S/0)S095919817977797281.2%/S1281322931126109278515.8%2.9S2430374237244145431852.1%1.6S31793521652821814231753525.0%4.1S47647937317047763447576143.1%4.3S519675931950715196013519594810.4%2.6S633657583348558360566234399934.2%1.8

檢測(cè)方法：雙抗夾心兩步法

結(jié)論

BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的穩(wěn)定性能，CV值控制在5%以內(nèi)與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。
BeaverBeadsTMStreptavidin對(duì)非特異性具有良好的控制，S0明顯低于進(jìn)口磁珠。
BeaverBeadsTMStreptavidin的靈敏度較高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。

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