點(diǎn)擊次數(shù)：2274 發(fā)布時(shí)間：2016/1/29

bradford法原理及bradford法測(cè)蛋白濃度實(shí)驗(yàn)步驟

    Bradford法是一種迅速、可靠的通過染色測(cè)定溶液中蛋白濃度的方法。又稱作考馬斯亮藍(lán)法。是1976年由Bradford建立。是根據(jù)蛋白質(zhì)與燃料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。

    具體Bradford法檢測(cè)原理: Bradford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測(cè).該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測(cè)定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.

操作Bradford法的實(shí)驗(yàn)步驟：

1、Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測(cè)定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn),如果待測(cè)樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20 g -150 g/100 l之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、將待測(cè)樣本溶于100 l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(好用PBS) 。

4、按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過濾除去。

5、每個(gè)樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘。

6、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。

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