【概述】

近年來基因毒性雜質(zhì)成為人們關(guān)注的焦點，甲磺酸酯、苯甲磺酸等磺酸類物質(zhì)與微量的低級醇在合成反應(yīng)中生成烷基磺酸如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、異丙基甲磺酸酯（IMS）、正丁基甲磺酸酯（NBMS），以及芳基磺酸酯如苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、對甲苯磺酸酯（MP-TS），這些物質(zhì)可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，因此控制藥物中該類雜質(zhì)的毒理學關(guān)注閾值（TTC）水平非常重要，歐洲醫(yī)藥評價署（EMEA）發(fā)布了關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 g/d。這些潛在基因毒性的存在引起管理機構(gòu)的高度重視]，為防止奈非那韋事件的發(fā)生，EMEA首先實施詳細指南控制雜質(zhì)限度，美國食品和藥物管理局（FDA）隨后頒布指南草案，國際藥品注冊協(xié)調(diào)會議（ICH）也對基因毒性雜質(zhì)做出限度規(guī)定，《歐洲藥典》增補版7.3明確指出采用衍生化法檢測藥物中MMS、EMS、IMS（2.5.38）。本文簡要介紹了近年來磺酸酯類雜質(zhì)檢測方法的研究進展，探討了不同檢測方法的特點及不足；同時說明了雜質(zhì)產(chǎn)生條件和避免該類雜質(zhì)產(chǎn)生的具體措施，從而有效地控制雜質(zhì)限度。

【實驗/設(shè)備條件】

表1.儀器參數(shù)設(shè)置

表2.分析物保留時間及定性定量離子

【實驗/操作方法】

溶液配制

標準溶液：取本品30 mg溶于10mL甲苯溶液中，取50 L置于容量瓶中采用80%乙腈水溶液稀釋至25mL，做為標準儲備液A。

準確稱取60g NaI+30 mg硫代硫酸鈉溶于50mL水中，做為衍生化試劑B。

將A稀釋至不同濃度的甲基磺酸酯1mL待用。

取以上0.5 mL甲基磺酸酯待用液+0.5mL衍生化試劑B于20mL頂空瓶中，待分析。

樣品的前處理

稱取某樣品50 mg，溶于0.5 mL 80%乙腈水溶液，加入0.5mLNaI溶液于頂空瓶中，待上機分析。

【實驗結(jié)果/結(jié)論】

頂空條件的選擇

本實驗選取80%乙腈水溶液做溶劑，可將待分析藥品完全溶解，溶劑中含大量有機溶劑因此頂空溫度不易過高，同時隨著樣品平衡溫度的升高，進入氣相的有機物的量增加，從而可以提高分析的靈敏度，但當孵化溫度過高時，對分析目標物碘代烷的靈敏度有影響，從而降低氣相中目標化合物的相對濃度，本實驗中主要考察了40℃、60℃、80℃的平衡溫度對靈敏度的影響，試驗結(jié)果表明選擇平衡溫度80℃時目標化合物的靈敏度最大，更適宜分析。實驗中傳輸線溫度選擇110℃以保證沒有水氣帶入色譜柱，影響分析效果。

當孵化時間增長分析物在水相和氣相兩相中的分配系數(shù)越小，當孵化時間達到一定時間分析物在兩相間達到最大的分配，此時為分析時間，本實驗中考察了10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，對孵化效率的影響，實驗最終結(jié)果表明，當孵化時間為20 min時效率最高。如下圖為不同孵化時間下孵化效率的比較圖。

圖1. 15 g/L甲基磺酸酯衍生后在不同膜厚Wax色譜柱上的分離情況

色譜柱的選擇

參考歐洲藥典8.0中對藥品中甲基磺酸酯的分析測定方法，符合藥品中基因毒性物質(zhì)限量要求。本方法采用NaI衍生法將甲基磺酸酯衍生為碘jia烷、碘乙烷、碘異丙烷，通過頂空法進行分析測定。分析的目標化合物碘jia烷、碘乙烷、碘異丙烷為極性低沸點化合物，因此采用極性色譜柱，本方法中考察了Tg-Wax 30 m 0.25 m 0.25 mm和Tg-Wax 30m 0.5 m 0.25 mm兩種不同膜后色譜柱，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當選擇膜厚為0.25 m的色譜柱時，由于衍生產(chǎn)物沸點低，在色譜柱上保留能力較小，需將初始溫度降到30℃低溫，此時色譜峰形較差，有托尾現(xiàn)象。

當選擇0.5 m色譜柱時，色譜峰拖尾得到改善，同時出峰時間推后，可將初始溫度升至35℃。如下圖為兩種色譜柱下分析物的色譜圖。

標準品色譜圖及樣品加標色譜

甲基磺酸酯為藥物生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，本方法選擇某樣品測定，發(fā)現(xiàn)其中含有甲基甲磺酸酯、甲基異丙基磺酸酯，某藥品中無其它物質(zhì)對所分析物質(zhì)干擾，如圖2為某樣品及其加標色譜圖。其中下圖為樣品加標色譜圖。

圖2.圖為加標1.5 g/g濃度樣品加標、樣品色譜圖，其中2.01為甲基磺酸甲酯，2.54為甲基磺酸乙酯，2.82為甲基磺酸異丙酯

線性、檢出限及RSD

配制濃度分別為：1.0、5.0、15.0、75.0、150 g/L的校準溶液，采用上述方法分別進樣分析，考察各組分在1.0-150 g/L濃度范圍內(nèi)的線性。實驗結(jié)果表明3種組分在1.0-150 g/L線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999（見表3）。

對某樣品添加混合標準溶液（加標濃度為0.02 g/g、1.5 g/g），考察三種甲基磺酸酯的加標回收情況。實驗結(jié)果表明各組分的加標回收率均在85.0-103%之間，符合日常分析檢測的要求。對0.02、1.5 g/g加標水平平行測定6次，平均RSD值在5.2-7.3%，符合穩(wěn)定性要求。

同時以三倍信噪比計算各組分檢出限，各組分儀器檢出限在0.2-1.0 g/L（見表3）。

表3.線性、檢出限及RSD數(shù)據(jù)（n=3）

結(jié)論

本實驗采用賽默飛世爾科技Triplus 300頂空自動進樣器結(jié)合1300GC配ISQ質(zhì)譜檢測器分析藥品中的3種基因毒性物質(zhì) 甲基磺酸酯，樣品通過衍生法采用頂空進樣方式，方法準確，靈敏度高，滿足檢測要求。

【儀器/耗材清單】

儀器：Trace 1310-ISQ SSL進樣口 Triplus-300頂空自動進樣器

色譜柱：TG-Wax MS, 30 m, 0.25 mm, 0.5 m

賽默飛氣相色譜儀,Thermo熱電氣相色譜,賽默飛氣質(zhì)聯(lián)用儀,熱電液相色譜,戴安離子色譜儀

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