1. 什么是內(nèi)毒素?
內(nèi)毒素一種在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的脂多糖(LPS)。它是一種典型的熱原,哪怕是皮克級(10-12 g)或納克級的(10-9 g)內(nèi)毒素進(jìn)入血液,也會引發(fā)各種生物反應(yīng)。因?yàn)槠溆兄蜔嵝院头€(wěn)定性,通過高壓蒸汽處理也不能完全使內(nèi)毒素滅活,需在250℃或以上的溫度下,干熱處理至少半小時才能使其滅活。它存在于革蘭氏陰性菌棲息的環(huán)境中(例如水,空氣),即使在細(xì)菌死亡后,細(xì)菌性的內(nèi)毒素(LPS)仍然存在。
圖1為脂多糖的結(jié)構(gòu)圖,如圖所示,脂質(zhì)A在該物質(zhì)中是負(fù)責(zé)生物活性的主要部分,這部分的分子量約為2000。包含糖鏈部分在內(nèi)的整個分子的分子量一般為5000到8000左右。然而,因?yàn)閮?nèi)毒素是一種同時擁有親水區(qū)(糖鏈)和疏水區(qū)(脂質(zhì)A)的分子,它能在水溶液中相互締合,形成表觀分子量為數(shù)十至數(shù)百萬的膠束結(jié)構(gòu)。有報告指出,膠束結(jié)構(gòu)的變化,會影響其生物活性的強(qiáng)弱。
圖2所示為大腸桿菌型和沙門氏菌型的脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)。從圖中能看出即使菌株不一樣,脂質(zhì)A的基本結(jié)構(gòu)在大體上仍然相同。
圖1. 脂多糖(LPS)結(jié)構(gòu)示意圖
圖2. 脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)(大腸桿菌型和沙門氏菌型)
2. 使用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)試劑的各種內(nèi)毒素檢測方法
由馬蹄蟹(美洲鱟)的阿米巴樣細(xì)胞溶解物制備的試劑可用于檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。如圖3所示,在內(nèi)毒素的參與下,級聯(lián)反應(yīng)開始進(jìn)行,其中C因子,一種絲氨酸蛋白酶前體,zui先被活化。隨后接下來的是B因子的活化,B因子也是一種絲氨酸蛋白酶前體和凝固酶前體,它能將凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝膠。在LAL測試中,內(nèi)毒素可以通過三種方式定量:對凝膠的形成進(jìn)行測定,對濁度的增加進(jìn)行測定,或?qū)τ珊铣傻孜锓纸舛尫懦龅狞Sse色原體進(jìn)行測定。
普通的LAL試劑不僅與內(nèi)毒素反應(yīng),而且會與(1 3)- -D-葡聚糖(真菌細(xì)胞壁成分)反應(yīng),因?yàn)镚因子途徑會在LAL試劑作用下被激活。為了消除這種(1 3)- -D-葡聚糖活化,在工業(yè)中通過去除G因子或抑制其活化,開發(fā)了各種內(nèi)毒素特異性試劑。
市場上有著各種基于圖3中的反應(yīng)機(jī)理所制得的LAL試劑以及檢測體系。因此,根據(jù)所需的準(zhǔn)確度、測試頻率、樣本數(shù)目以及其他相關(guān)因素來選擇最合適的產(chǎn)品是十分重要的。
圖3. LAL試劑反應(yīng)機(jī)理
美國,歐洲和日本的藥典中包含了三種內(nèi)毒素檢測方法,分別是凝膠法、比色法和比濁法,我們會在下面的章節(jié)中詳述,并且會介紹相關(guān)的LAL試劑的特點(diǎn)以及其應(yīng)用實(shí)例。
(1) 凝膠法
將樣本與LAL試劑在試管中混合,并使用干浴器,在37 1 C下,孵育60 2min,期間不要振動。加熱完成后,立即緩慢地將試管傾斜180 。如果凝膠已形成并能保持其完整性而不變形或塌陷,則結(jié)果可確定為陽性,而如果未形成凝膠則為陰性。在檢測期間,對于一系列樣本,要進(jìn)行多倍稀釋(通常為2倍),以檢查每個樣品的結(jié)果是否為陽性。確定為陽性的最大有效稀釋倍數(shù)或最小濃度被稱為終點(diǎn)。
相關(guān)試劑
在單次型試劑盒和多次型試劑盒中都包含LAL試劑,其中單次型試劑盒中的反應(yīng)小瓶包含了預(yù)分裝好的用于單次檢測的LAL試劑,而多次型試劑盒則是將所需量的已經(jīng)溶解好的LAL試劑裝入到反應(yīng)瓶中。單次型試劑盒非常適用于少量樣品的檢測,而多次型試劑盒則適用于樣本量更多的檢測。
多次型試劑盒的使用方法式是將0.1mL已經(jīng)溶解好的LAL試劑分裝到反應(yīng)管中,然后再加入0.1mL樣品,并將其混合。而單次型試劑盒的使用方法則是將0.2mL樣本加入到含有預(yù)先分裝好的LAL凍干試劑的反應(yīng)小瓶中。
ES-II系列
特異性內(nèi)毒素LAL試劑(不會被(1 3)- -D-葡聚糖活化),與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(BET)(日本藥典)相兼容。其膠凝靈敏度為0.015 EU/mL,單次型和多次型試劑盒均有提供。
(2)比色法
由于內(nèi)毒素會使LAL試劑活化,比色法是根據(jù)其對顯色底物的分解來檢測其活化。由于對硝基苯胺的黃色的吸光度是在405 nm波長下檢測的,如果樣品在約405 nm波長下具有相當(dāng)大的光吸收,則不宜使用比色法。
相關(guān)試劑
Color KY 系列
內(nèi)毒素特異性比色法LAL試劑,與BET(日本藥典)一致性測試相兼容。與Toxinometer 結(jié)合使用的單次型試劑盒,以及與酶標(biāo)儀和Toxinometer 結(jié)合使用的多次型試劑盒,可用于動態(tài)比色測試。這些系列在我們的試劑產(chǎn)品有著最高的靈敏度:檢測限為0.0002 EU/mL(單次型)和0.0005 EU/mL(多次型)。
(3)比濁法
比濁法利用凝膠濁度的變化來檢測由內(nèi)毒素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的LAL試劑的活化。它不適用于具有一定濁度的樣品。
相關(guān)試劑
ES-F系列和ES-II系列
在動態(tài)比濁法測量中,可以將ES-F系列、ES-II系列與酶標(biāo)儀和Toxinometer 結(jié)合使用。這些試劑盒不僅能獲得凝膠法的結(jié)果,同時能得到動態(tài)比濁法的數(shù)據(jù),測量時間為60 min。
3.對檢測用具的要求
用于內(nèi)毒素檢測的所有檢測用具必須不含內(nèi)毒素和 -葡聚糖。為使內(nèi)毒素失活,需要在250 C下干熱處理超過30 min。建議使用經(jīng)干熱滅菌的玻璃器皿。避免使用金屬工具,因?yàn)榧词褂猩倭勘幌疵摮龅慕饘匐x子(例如鐵,鋁,鎵,鉻),也可能影響測試。而當(dāng)使用一次性塑料工具(其制造商未能保證其能用于檢測用途)時,檢查它們是否滿足以下要求(與玻璃器皿相比):1)未被內(nèi)毒素污染; 2)不吸附內(nèi)毒素; 3)無洗脫物。
4.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品
根據(jù)檢測目的使用適當(dāng)類型的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。
需符合BET(美國藥典/ 歐洲藥典 / 日本藥典)的檢測,例如藥品和醫(yī)療器械的產(chǎn)品最終檢驗(yàn)
必須使用美國藥典,歐洲藥典或日本藥典標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品。
對材料,工藝流程和其他相關(guān)主題的檢測
可以使用內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)。
5. 樣本干擾
有時候需要采取預(yù)防措施,以防止樣本對內(nèi)毒素檢測有潛在影響(反應(yīng)干擾)。這些干擾分為以下兩種類型:
(1)對LAL試劑的干擾
蛋白變性劑(例如酸,堿,尿素,表面活性劑,有機(jī)溶劑)
蛋白酶和蛋白酶抑制劑
螯合劑(會清除反應(yīng)所需的鈣和鎂)
對于比色法:著色物質(zhì)(在約405 nm處具有相當(dāng)大吸收的物質(zhì))
對于比濁法:濁度
(2)對內(nèi)毒素的干擾
金屬離子(例如鐵,鋁,鎵和鉻離子。即使微摩爾級別的存在也會對測試產(chǎn)生影響)
表面活性劑
樣本的干擾效果可以通過進(jìn)行藥典中的干擾因子測試來衡量:即通過對加標(biāo)了已知量的內(nèi)毒素的樣本進(jìn)行檢測,獲得加標(biāo)內(nèi)毒素的回收率。如果回收率在50%至200%范圍內(nèi),則可以確定該樣本不會造成影響,換句話說,檢測所得的內(nèi)毒素濃度是正確的。如果發(fā)現(xiàn)樣本會造成影響,可以通過對樣本溶液進(jìn)行稀釋,從而減少對測試的影響。然而,對樣本溶液的稀釋會提高了由原始溶液(預(yù)稀釋溶液)的濃度轉(zhuǎn)換而得的內(nèi)毒素濃度值。合理的稀釋倍數(shù)(最大有效稀釋倍數(shù)),是根據(jù)待檢測的內(nèi)毒素的所需濃度以及所用LAL試劑的檢測靈敏度來確定的。欲了解反應(yīng)干擾因子和最大有效稀釋度的詳細(xì)信息,詳見藥典中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。
6. Limulus ES的原理(內(nèi)毒素特異性試劑)
圖4. 鱟試驗(yàn)反應(yīng)級聯(lián)
LAL試劑和內(nèi)毒素的級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制如圖4所示。如果反應(yīng)體系中存在(1 3)- -D-葡聚糖*,會激活G因子,引起伴有凝膠化的假陽性反應(yīng)。在這種情況下,無論體系中是否存在內(nèi)毒素,都會發(fā)生反應(yīng),意味著無法對內(nèi)毒素進(jìn)行特異性檢測。為此,我們研發(fā)出Wako s Limulus ES,該產(chǎn)品通過在反應(yīng)體系中加入過量共存的(1 3)- -D-葡聚糖(羧甲基化凝膠多糖),從而來抑制(1 3)- -D-葡聚糖的干擾。因此, -葡聚糖對LAL試劑的活化受到抑制,從而使內(nèi)毒素特異性檢測能夠進(jìn)行。過量的 -葡聚糖可以抑制其自身反應(yīng)的原理如圖5所示: -葡聚糖和LAL試劑之間反應(yīng)的濃度范圍對于整個反應(yīng)而言很窄。另一方面,內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)在很寬的濃度范圍內(nèi)都會發(fā)生,并且不受大量共存的 -葡聚糖的任何干擾。Wako的Limulus ES就是根據(jù)這個原理而制作的(見圖6)。
*(1 3)- -D-葡聚糖來源于霉菌(真菌)或經(jīng)纖維素濾膜過濾所得。
圖5. 羧甲基化凝膠多糖和LAL反應(yīng)
使用Toxinometer (檢測時間設(shè)定為99 min)和Limulus HS進(jìn)行檢測。
○在99 min內(nèi)檢測不到凝膠的生成
●有凝膠的生成
圖6. 羧甲基化凝膠多糖對使用Limulus HS和Limulus ES進(jìn)行的內(nèi)毒素檢測的影響
A:Limulus HS
B:Limulus ES
○內(nèi)毒素的系列稀釋
▲含有1 g/mL羧甲基化凝膠多糖的內(nèi)毒素系列稀釋
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號
產(chǎn)品名稱
規(guī)格
包裝
295-72301
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL)
for Endotoxin Detection
25 tests
291-75701
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F MULTI TEST (without CSE)
for Endotoxin Detection
100 tests
295-51301
Limulus ES- II Single Test wako
鱟試劑ES- II Single(適用于溶膠凝膠法和動態(tài)比濁法)
for Endotoxin Detection
25 tests
299-51201
Limulus ES- II Test wako
鱟試劑ES- II (適用于溶膠凝膠法和動態(tài)比濁法)
for Endotoxin Detection
60 tests
292-51213
Limulus Amebocyte Lysate ES-II,Lyophilized
鱟試劑LAL ES-II(適用于溶膠凝膠法和動態(tài)比濁法)
for Endotoxin Detection
2 mL 5
293-75401
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (with CSE)
for Endotoxin Detection
160 tests
297-75301
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (without CSE)
for Endotoxin Detection
200 tests
291-53601
Limulus Color KY Single Test wako
for Endotoxin Detection
25 tests
291-53101
Limulus Color KY Test Wako
for Endotoxin Detection
60 tests
290-33771
Toxinometer ET-6000/J Standard Set
內(nèi)毒素檢測儀ET-6000/J
1 set
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