細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素。其化學(xué)成分本質(zhì)為磷脂多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，毒性成分主要為類脂質(zhì)A。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯否細(xì)胞滅活，不造成機(jī)體損害。大量進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)后可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等反應(yīng)——又叫“熱原反應(yīng)”。因此，生物制劑、注射劑、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類（如一次性注射器，植入性生物材料）必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)合格后才能使用。

化學(xué)藥品注射劑除內(nèi)毒素策略及超濾去除內(nèi)毒素的應(yīng)用及優(yōu)勢。在化學(xué)藥品注射劑的制備過程中，難以避免的會(huì)從原輔料，過程，人員，設(shè)備和環(huán)境等環(huán)節(jié)中引入微生物及內(nèi)毒素。出于藥物安全的考量，藥典對(duì)于化學(xué)注射劑的內(nèi)毒素水平有嚴(yán)格的限定。這要求注射劑生產(chǎn)企業(yè)采取合理的策略，嚴(yán)格控制注射劑中的內(nèi)毒素含量。

 內(nèi)毒素特點(diǎn)

1.耐熱：100℃，加熱1小時(shí)，不會(huì)被破壞。只有在160℃，加熱2–4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。

2.抗原性弱：內(nèi)毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素；把內(nèi)毒素注射到機(jī)體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量的特異免疫產(chǎn)物（稱為抗體），中和作用較弱。

內(nèi)毒素的檢測

內(nèi)毒素的檢測常用家兔熱原法和鱟試驗(yàn)法。由于家兔對(duì)“熱原”的反應(yīng)與人基本相似，所以半個(gè)世紀(jì)以來用家兔來檢測熱原，為保障藥品質(zhì)量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。1956年美國人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng)，從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確，已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗(yàn)等方面。鱟的來源目前主要有2大區(qū)域，除了美洲還有亞洲的中國鱟。

(圖片來自網(wǎng)絡(luò))

2005年版中國藥典規(guī)定168個(gè)品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。其中收錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括2種：凝膠法和光度法，都是使用鱟試劑檢測內(nèi)毒素。前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)（比色）法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來定量測定內(nèi)毒素。比色法又可分為終點(diǎn)顯（比）色法和動(dòng)態(tài)比色法。該方法靈敏度、精密度高。

鱟試驗(yàn)收載于1980年20版美國藥典，又叫細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（BET，Bacterial Endotoxin Test）；隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載。此后鱟試驗(yàn)逐漸替代家兔熱原試驗(yàn)。但由于部分藥品自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，故鱟試驗(yàn)無法完全取代家兔熱原試驗(yàn)。

鱟試劑是鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有絲氨酸蛋白酶原(C因子)、G因子。其中，C因子能被細(xì)菌內(nèi)毒素激活，G因子能被真菌葡聚糖激活，引起一系列酶促反應(yīng)。根據(jù)鱟試劑反應(yīng)原理，分別有針對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖兩種檢測試劑盒，用于細(xì)菌內(nèi)毒素含量和真菌感染的檢測(G試驗(yàn))。

原則解讀

該指導(dǎo)原則是對(duì)《1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》內(nèi)容和應(yīng)用做進(jìn)一步的說明。歸納起來有以下幾個(gè)重點(diǎn)：

1.詳細(xì)闡釋了內(nèi)毒素限值的設(shè)定依據(jù)：

內(nèi)毒素限值由公式“L = K/M”計(jì)算得到。其中M為“人用每千克體重每小時(shí)最大供試品劑量“，詳見《1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》對(duì)公式的解讀。K的取值考慮了不同劑型的特點(diǎn)。

指導(dǎo)原則中增加了“聯(lián)合用藥”“嬰幼兒”“營養(yǎng)不良”和“惡病質(zhì)”等情況的用藥?？紤]到細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)體弱患者人群可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的影響而更加嚴(yán)格的控制最大可接受量。100 mL及以上裝量的大輸液類制劑，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般不得超過0.50 EU/mL。

 2.對(duì)于測量方法的選擇的考量：

對(duì)于這兩種檢查方法，可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。凝膠法簡便易操作，有可能不能排除干擾作用；光度法可以定量，并且預(yù)測趨勢。凝膠法常用的反應(yīng)容器為10 mm × 75 mm的玻璃小試管或空安瓿等，光度法常用的反應(yīng)容器為測定儀專用試管或酶標(biāo)板。

凝膠法：凝膠法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進(jìn)行檢驗(yàn)。若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)供試品的前處理進(jìn)行研究，再用干擾試驗(yàn)驗(yàn)證能否使用凝膠法。由于動(dòng)態(tài)法的檢測限范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數(shù)，對(duì)于部分使用凝膠法無法排除干擾的樣品，可以嘗試使用動(dòng)態(tài)法建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法。

光度法：包括濁度法和顯色法，可定量檢測內(nèi)毒素的含量。能較為準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，定量檢測的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，更易達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。光度測定法可通過回收率判斷出干擾的趨勢，尤其對(duì)于研究性質(zhì)的樣品(如新產(chǎn)品)更具有優(yōu)勢。

3.供試品的前處理技術(shù)：

*溶解樣品：內(nèi)毒素檢查用水

*助溶：超聲波、加熱、助溶劑、調(diào)節(jié)pH等

*有機(jī)溶劑（如乙醇、DMSO等）溶解時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)

*包合技術(shù)（如微球、脂質(zhì)體），采取適宜方法破壞，釋放內(nèi)毒素

4.檢查法的建立：

鱟試劑反應(yīng)的一致性：應(yīng)使用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑對(duì)至少三批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

不宜建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的情況：

*無法排除供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用

*只能使用最高靈敏度鱟試劑（凝膠法0.03 EU/mL，光度法0.001 EU/mL）排除干擾

5.其他：

*避免支間差異：規(guī)格大于0.1 mL/支裝量的鱟試劑時(shí)，為避免支間活性差異帶來的影響，應(yīng)復(fù)溶后混合，再分裝使用。

*若MVD值不是整數(shù)，可以使用小于MVD的整數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

6.重組C因子法

對(duì)于含有β葡聚糖干擾的樣品檢測，該原則中給出了“重組C因子法”進(jìn)行測試。C因子是鱟試劑中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識(shí)別內(nèi)毒素。被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后，可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號(hào)。

重組C因子法試驗(yàn)需采用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)/發(fā)射波長一般為: 380 nm/440 nm，檢測溫度一般為37°C ± 1°C。

檢測與除雜

內(nèi)毒素不僅可以通過快速檢測，還可以通過專用的酶標(biāo)儀配合相關(guān)試劑精準(zhǔn)檢測。對(duì)于實(shí)驗(yàn)用水中的內(nèi)毒素，可以使用專用的超濾設(shè)備以及純水機(jī)進(jìn)行測試。91儀器信息網(wǎng)編輯整合了相關(guān)資源，為廣大制藥工作者提供參考。

快速檢測平臺(tái)

查士利華檢測平臺(tái)支持相同的卡片技術(shù)，準(zhǔn)確、方便、實(shí)時(shí)檢測內(nèi)毒素和葡聚糖濃度。此外，每個(gè)系統(tǒng)都與Charles River Cortex 數(shù)據(jù)管理軟件平臺(tái)集成，創(chuàng)建了一個(gè)真正強(qiáng)大，可控的內(nèi)毒素檢測程序。

Endosafe nexgen-PTS 新一代便攜式檢測系統(tǒng)

實(shí)拍Endosafe nexgen-PTS

15分鐘內(nèi)提供定量鱟實(shí)驗(yàn)結(jié)果；FDA認(rèn)證，檢測范圍在0.005-10 EU/mL；系統(tǒng)便攜，采樣現(xiàn)場直接獲得檢測結(jié)果。

Endosafe nexgen-MCS 多卡片式細(xì)菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)

高樣品通量，多個(gè)卡片共同測定，疊加的臺(tái)式系統(tǒng)；15分鐘內(nèi)可同時(shí)檢測5個(gè)樣品；樣品獨(dú)立檢測，允許隨時(shí)插取，無需等待整批取樣。

Endosafe Nexus 全自動(dòng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)

消除技術(shù)人員在樣品制備上可能造成的差異；客戶僅需要添加帶條形碼的樣品到平臺(tái)上即可完成。

鱟試劑專用酶標(biāo)儀

Thermo Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀

Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀是使用鱟試劑檢測細(xì)菌內(nèi)毒素適配的酶標(biāo)儀。在傳統(tǒng)酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上，專為內(nèi)毒素檢測優(yōu)化設(shè)計(jì)光路，可滿足不同鱟試劑檢測需求。單通道檢測，避免了多通道檢測中不同光路之間的差異，另有2個(gè)參比通道，確保讀數(shù)的高度精確性。檢測波長范圍340–850 nm，滿足多種鱟試劑檢測需求，可進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯色法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測。適用于微量96孔板，在提高檢測通量的同時(shí)，降低實(shí)際成本。

內(nèi)置自我診斷程序，在啟動(dòng)階段，系統(tǒng)對(duì)載板位置、光源和濾光片在內(nèi)的各種相關(guān)參數(shù)進(jìn)行全面的檢測，確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠內(nèi)置振蕩器及孵育器。最高溫度達(dá)50℃，有熱蓋設(shè)計(jì)保證溫控精確，滿足內(nèi)毒素檢測的溫度。

過濾模塊

Merck——盒式超濾膜包Pellicon 2

超濾去除內(nèi)毒素，使用孔徑小于內(nèi)毒素聚體的膜截留內(nèi)毒素而讓料液通過。使用8kD或者10kD的超濾膜包，內(nèi)毒素截留率通?？梢赃_(dá)到99.99%以上。超濾后的液體無相變，無雜質(zhì)，不影響產(chǎn)品量；可驗(yàn)證；通量高，產(chǎn)品收率高。設(shè)備易于清洗消毒除熱原，可重復(fù)使用。

超純水機(jī)——去除內(nèi)毒素等雜質(zhì)

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