菌種作為一項(xiàng)重要的生物資源，對(duì)微生物學(xué)教學(xué)和研究是必不可少的。菌種保存方法因微生物的不同而異。在菌種保存過(guò)程中，必須使微生物的代謝處于MAX不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，故菌種保存方法多依據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)。

       菌種保存方法有多種，較合適的為真空冷凍干燥法，具有保存時(shí)間長(zhǎng)、成活率高、變異小等優(yōu)點(diǎn)，但操作技術(shù)難度大，花費(fèi)高，需特殊設(shè)備，一般單位不易做到，而一些常規(guī)方法，常因傳代次數(shù)多、易污染、易變異，給保存帶來(lái)諸多不利。

       一、需要4℃冰箱保存

       1、液體石蠟保存法

       先將液體石蠟滅菌，然后放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將需要保存的菌種在MAX適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無(wú)菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)。試管需直立，置4℃或室溫下保存，一般無(wú)芽胞細(xì)菌可保存1年左右。

       2、高層半固體瓊脂石蠟保存法

       將需保存的菌種經(jīng)平板劃線(xiàn)分離后，挑單個(gè)菌落用接種針?lè)磸?fù)穿刺接種到高層半固體瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃12小時(shí)培養(yǎng)后取出，用無(wú)菌操作將滅菌的液體石蠟滴加半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年轉(zhuǎn)種1次。

       3、蒸餾水保存法

       取滅菌蒸餾水6-7ml加于試管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混勻，將此菌液分裝于滅菌的螺旋小瓶中，或用膠塞密封，置4℃保存可存活數(shù)年。

       二、需-20℃冰箱冷凍保存

       1、甘油保存法

       甘油一生理鹽水保存液的制備：取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份，充分混合后，經(jīng)121.3℃30分鐘滅菌備用。

       將純化后的菌株根據(jù)菌種不同分別劃線(xiàn)接種于其MAX適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，用接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養(yǎng)6-8小時(shí)(鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管，5-10%CO2環(huán)境下8-10小時(shí)培養(yǎng)，真菌直接用接種環(huán)取菌洗入肉湯管，不培養(yǎng))。此為培養(yǎng)液。

       將此培養(yǎng)液與保存液以5：2的比例混合分裝于滅菌的微量離心管，置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用時(shí)需37℃水浴中快速解凍。

       用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，鏈球菌、奈瑟菌可存活12-15個(gè)月，且性狀未發(fā)生變異。此方法采用幼齡肉湯培養(yǎng)物效果好，且適用于鏈球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

       2、低溫保存法

       菌種保存液的配制：K2HPO412.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4 7H2O0.18g，KH2PO43.6g，甘油88g加蒸餾水至1000ml，103.4KPa滅菌30分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

       將細(xì)菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，或斜面培養(yǎng)物刮取于生理鹽水中，然后加入等體積的菌種保存液，凍存于-70℃或-20℃冰箱中。

       此方法也適合甲鏈、肺球、流感桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌等耐受力低的細(xì)菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。

       3、細(xì)菌濕種牛奶凍存法

       新鮮牛奶或15%奶粉煮沸，冷卻脫脂，分裝小試管，每管1ml，8磅15分鐘滅菌備用。

       將純種菌接種于平板，37℃16小時(shí)培養(yǎng)，以接種環(huán)刮取菌苔2-3環(huán)于牛奶中混勻，試管用硅膠塞，凍存于普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用時(shí)取出室溫溶解，待部分溶解時(shí)即可取一環(huán)接種平板，并將試管再迅速凍存，這樣可反復(fù)使用3-5次。此法一般菌株可存活48個(gè)月，少數(shù)如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可存活14-30個(gè)月。

       4、甘油原液保存法

       將各待保存的菌種純化后用接種環(huán)直接從平板上刮取，置于盛有0.5ml甘油原液的菌種瓶中，低溫保存箱-20℃保存，可連續(xù)52個(gè)月存活良好。

       此法尤其適合乙鏈、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種，是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的有效保存方法。

       三、需低溫-30或-70℃冰箱保存

       全羊血冷凍菌種保存法

       1、脫纖維羊血

       無(wú)菌抽取羊頸靜脈血后，沿瓶壁注入無(wú)菌的帶玻璃的三角燒瓶中，同時(shí)立即同一方向振搖約8-10分鐘，脫去纖維，然后分裝加蓋無(wú)菌小試管中約1.0-1.5ml。

       將腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分別接種于血平板培養(yǎng)基中，前兩者置于5-10%CO2燭缸內(nèi)，經(jīng)35℃16-18小時(shí)培養(yǎng)，后三者置37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，然后無(wú)菌操作取一接種環(huán)菌苔移種于上述新鮮脫纖維羊血試管中，立即置-3O℃冰凍保存二年轉(zhuǎn)種一次。用時(shí)室溫自然冰融即可接種。

       2、紙片法

       新華定性濾紙剪成4mm 4mm，1.5ml帶蓋離心管消毒滅菌備用，用消毒小鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取待保種的純菌落2-3個(gè)。放于離心管內(nèi)塞蓋再用封口膠布將蓋邊緣封好放于-30℃冰箱保存。保存12個(gè)月后取出菌種解凍后用無(wú)菌鉗取一片放于肉湯管內(nèi)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后轉(zhuǎn)種血平板，性狀未變異。

       3、奶粉液菌種保存法

       菌種保存液：脫脂奶粉10g，NaCL10.5g，加雙蒸水100ml，121℃5分鐘高壓滅菌后分裝于1ml帶蓋無(wú)菌標(biāo)本杯中(0.5ml)備用。

       無(wú)菌操作用4mm 10mm無(wú)菌濾紙條蘸取新鮮菌少許，放存含奶粉液保存杯中，蓋好，封口膠封口，低溫保存。3年存活率達(dá)99.2%。

       使用時(shí)將標(biāo)本杯取出，不等全部融化，上層有少許融化即用接種環(huán)取一少許接種于血平板分離即可。

       四、結(jié)論

        菌種是細(xì)菌工作中所不可缺少而又具有傳染性生物學(xué)因子。為了保證工作和安全，對(duì)菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死，還要求其生物學(xué)性狀、生理特性、抗原性等方面不發(fā)生變異，這是保存菌種的重要環(huán)節(jié)。延長(zhǎng)菌種存活期應(yīng)注意：首先，待保存菌種須選擇生長(zhǎng)期幼齡培養(yǎng)物，且制成濃菌液保存，以保證存活率。其次，高層半固體培基建議選擇不含或含糖量低的培基，可減少或避免因代謝產(chǎn)物產(chǎn)生而造成的細(xì)菌死亡。MAX后，保存溫度的高低可影響存活率，切忌反復(fù)凍融。

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