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芽孢又叫內(nèi)生孢子，通常為圓形或橢圓形，是芽孢桿菌屬和梭菌屬生長到一定階段形成的一種抗逆性很強(qiáng)的體眠體結(jié)構(gòu)。芽孢染色可以用的染料很多,但是由于芽孢壁厚、透性低，所以著色、脫色均較困難。

芽孢染色原理

芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。一般芽孢染色時會選用弱堿性染料，如：如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色。染色時染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。常用的芽孢染色法是孔雀石綠染色法，芽孢被染上青綠色，而菌體被番紅復(fù)染為紅色。

芽孢染色方法

方法1

（1）將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3 5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4-5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6%）染10分鐘。

（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無色。

（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

注意事項

（1）選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡菌尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已經(jīng)破裂。

（2）加熱染色時必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

方法2

（1）取二支潔凈的小試管，分別加入0．2ml無菌水，再往一管中加入1-2接種環(huán)的蠟狀芽孢桿菌的菌苔，另一管中加入1-2接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔，兩管各自充分混合成濃厚的菌懸液。

（2）在菌懸液中分別加入0．2ml苯酚品溶液，充分混合后，于沸水浴中加熱3-5分鐘。

（3）用接種環(huán)分別取上述混合液2-3環(huán)于兩片載玻片上，涂薄，風(fēng)干后，將載玻片稍傾斜于燒杯上，用95%乙醇沖洗至無紅色液流出。

（4）再用自來水沖洗，濾紙吸干。

（5）取1 2接種環(huán)黑色素溶液于涂片處，立即展開涂薄，自然干燥后，油鏡觀察，在淡紫灰色背景的襯托下，菌體為白色，菌體內(nèi)的芽孢為紅色。

芽孢染色注意事項

1.為了防止細(xì)菌體和孢子體熱脹冷縮過于劇烈而發(fā)生形變從而影響兩者之間形狀區(qū)別的觀察，芽孢染色時需要進(jìn)行加熱。

2.芽孢出現(xiàn)在微生物生長曲線的衰亡期,剛菌齡較小的菌是不會產(chǎn)生芽孢的.而菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛,所以芽孢染色用的菌種要控制菌齡。

鏡檢怎樣區(qū)分芽孢死活，用什么染色劑

要區(qū)別芽孢死活用一般染色劑難以做到，芽孢本來就是休眠體，你想想休眠的動物如蛇、青蛙、熊，你怎么區(qū)分他們是死是活？當(dāng)然是把他們放在合適的環(huán)境下，活的就會表現(xiàn)出活的跡象，比如呼吸、心跳...同理，在載玻片上芽孢區(qū)域滴上幾滴芽孢萌發(fā)劑，常見的有AGFK、L-丙氨酸、葡萄糖等，這個搜索到，查文獻(xiàn)亦可，置于30 培養(yǎng)箱30分鐘，然后鏡檢，能夠萌發(fā)成營養(yǎng)體的就是有活性的芽孢，反之就是死的（但不排除萌發(fā)受體缺失突變的芽孢，自然情況下是很少出現(xiàn)的，一般科學(xué)研究中才會人為篩選出）。

上海嵐興生物科技為生化試劑供應(yīng)商，專業(yè)生產(chǎn)銷售生化試劑、生物試劑、細(xì)胞培養(yǎng)、試劑盒、實驗耗材等產(chǎn)品。芽孢染色試劑盒利用芽胞具有高度的折光性，外膜致密，滲透性低，著色和脫色均較困難。在加熱條件下進(jìn)行染色時，染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料可被酒精脫色，而芽胞上的染料仍保留，經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染后，菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色。

芽孢染色試劑盒使用步驟：

1、制作一適當(dāng)厚度的細(xì)菌涂片，自然干燥，通過火焰加熱固定。

2、滴加適量染色液 A 于涂片上，在酒精燈上加熱，使染液冒蒸汽但不沸騰。必要時可續(xù)加染液以免干涸。維持 4-5 分鐘。

3、待標(biāo)本冷卻后以 95%酒精脫色液沖洗至無紅色染液脫出為止，水洗。

4、滴加染色液 B 復(fù)染約 2-3 分鐘，水洗至無染液脫出為止。

5、待干后油鏡觀察。預(yù)期結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽孢呈紅色。

注意事項：

1.供芽孢染色用的培養(yǎng)物應(yīng)控制菌齡，要求大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)為宜。

2.加熱染色時必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

3.請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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