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技術(shù)文章 綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 閱讀：55 發(fā)布時(shí)間：2019/4/15
綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定綿羊血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）水平。用純化的綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF），再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中綿羊促生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH；GHRF）含量。
試劑盒組成：
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說(shuō)明書(shū)
1份
1份
封板膜
2片
2片
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1 48
1 96
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3ml 6管
0.3ml 6管
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
5 ml 1瓶
10 ml 1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml 1瓶
6 ml 1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml 1瓶
6 ml 1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml 1瓶
6 ml 1瓶
2-8℃保存
終止液
3 ml 1瓶
6 ml 1瓶
2-8℃保存
20 濃縮洗滌液
15ml 1瓶
25ml 1瓶
2-8℃保存
注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：24、12、6、3、1.5、0 ng/mL.
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 L；。加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 l，然后再加待測(cè)樣品10 l（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100 l，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A50 l，再加入顯色劑B50 l，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液50 l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（ n 5）。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。底物請(qǐng)避光保存。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。
檢測(cè)范圍：
0.75 ng/mL - 24 ng/mL
靈敏度：
最低檢測(cè)濃度小于0.1 ng/mL
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6個(gè)月
Sheep growth hormone releasing hormone
FOR RESEARCH USE ONLY
Drug Names
Generic Name：Sheep growth hormone releasing hormone (GHRH；GHRF) ELISA Kit.
Purpose
This kit allows for the determination of GHRH；GHRF concentrations in Sheep serum, plasma, tissue homogenates and other biological fluids.
Principle of the assay
The kit assay Sheep GHRH；GHRF level in the sample, use Purified Sheep GHRH；GHRF antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add GHRH；GHRF to the wells, Combined antibody which With HRP labeled, become antibody-antigen-enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of GHRH；GHRF in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
Materials provided with the kit
Materials provided with the kit
48determinations
96 determinations
Storage
User manual
1
1
Closure plate membrane
2
2
Sealed bags
1
1
Microelisa stripplate
1
1
2-8℃
Standard
0.3ml 6 bottle
0.3ml 6 bottle
2-8℃
HRP-Conjugate reagent
5ml 1 bottle
10ml 1 bottle
2-8℃
Sample diluent
3ml 1 bottle
6ml 1 bottle
2-8℃
Chromogen Solution A
3ml 1 bottle
6ml 1 bottle
2-8℃
Chromogen Solution B
3ml 1 bottle
6ml 1 bottle
2-8℃
Stop Solution
3ml 1 bottle
6ml 1 bottle
2-8℃
20 Wash solution
15ml 1 bottle
25ml 1 bottle
2-8℃
Note: Standard concentration was followed by:
24、12、6、3、1.5、0 ng/mL.
Specimen requirements
serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20 mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidly frozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃ after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.Can t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.Assay procedure
1. Add standard: Set Standard wells, testing sample wells. Add standard 50 l to standard well.
2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40 l to testing sample well, then add testing sample 10 l (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.
3.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 100 l to each well, except blank well.
4.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 60 min at 37℃.
5.Configurate liquid: 20-fold wash solution diluted 20-fold with distilled water and reserve.
6.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.
7.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃
8.Stop the reaction：Add Stop Solution 50 l to each well, Stop the reaction(the blue color change to yellow color).
9.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.
important notes
Calculate
Assay range
0.75 ng/mL - 24 ng/mL
Sensitivity
The minimum detectable dose is typically less than 0.1 ng/mL
Storage and validity
1．Storage： 2-8℃.
2．validity： six months.
上?？ㄅ锟萍加邢薰?- 主營(yíng)產(chǎn)品： sigma試劑,標(biāo)準(zhǔn)品,試劑,生化試劑
地址：上海市楊浦區(qū)民京路459號(hào) 聯(lián)系電話(huà)：021-54652189 手機(jī)：13788942867 傳真：91化工儀器網(wǎng) 設(shè)計(jì)制作，未經(jīng)允許翻錄必究 . Copyright(C) http://www.chem17.com, All rights reserved. 以上信息由企業(yè)自行提供，信息內(nèi)容的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負(fù)責(zé)，91化工儀器網(wǎng)對(duì)此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
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