一、病毒載體系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)基因技術(shù)，一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具，將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對宿主細胞的感染性，將外源基因?qū)胩囟毎?，廣泛應(yīng)用于基因診斷和基因治療。

二、慢病毒包裝簡介

病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒。慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷丨型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因載體。

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能使外源基因整合入宿主的基因組穩(wěn)定、長期表達，比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體(產(chǎn)生病毒顆粒所需的輔助蛋白)一同轉(zhuǎn)染包裝細胞，即可進行病毒的包裝；包裝好的慢病毒為假型病毒（毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代），然后分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，經(jīng)過離心取得上清液，再濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而實現(xiàn)外源基因在宿主細胞中的表達。

三、慢病毒載體系統(tǒng)

慢病毒載體系統(tǒng)：包裝成分和載體成分。

產(chǎn)生慢病毒顆粒的輔助成分：慢病毒包裝質(zhì)粒和包裝細胞系。

慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。

慢病毒包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。

將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞(如人腎293T細胞)，即可在細胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

四、病毒包裝實驗步驟

1、目的基因真核表達載體構(gòu)建流程圖

2、質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞

3、慢病毒感染細胞

感染步驟：

①鋪板：將對數(shù)生長期的細胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長過夜。

②感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。

③24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體根據(jù)細胞狀態(tài)來看。

4、感染后細胞檢測方法

蛋白提取及Western檢測

western-Bloting：蛋白免疫印跡，一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個部分組成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移 （轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或 X 光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測中。

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