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文檔簡介 胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下測量不同激發(fā)波長下相對熒光峰值的比值，來測定細(xì)胞漿總鈣離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞（動(dòng)物、人體等）或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。技術(shù)背景鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calciumfluorophosphateapatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexedcalcium）和離子鈣（ionizedcalcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscularexcitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flamephotometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體、細(xì)胞漿分離。Fura-2AM（acetoxy-methylester），一種具有細(xì)胞膜通透性，與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，通過其不同激發(fā)波長340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比（散發(fā)波長510nm）來精確測定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。產(chǎn)品內(nèi)容清理液（ReagentA）40毫升染色液（ReagentB）30微升介導(dǎo)液（ReagentC）600微升飽和液（ReagentD）2毫升陰性液（ReagentE）2毫升裂解液（ReagentF）200微升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存染色液（ReagentB）和介導(dǎo)液（ReagentC）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育96孔培養(yǎng)板：用于樣品操作的容器熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察實(shí)驗(yàn)步驟測定準(zhǔn)備設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長340nm和380nm，散發(fā)波長510nm測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（ReagentB）室溫下融化，然后分別移出30微升介導(dǎo)液（ReagentC）和1.5微升染色液（ReagentB）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。二、熒光酶標(biāo)儀檢測準(zhǔn)備1個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對照孔（不含細(xì)胞）、最大對照孔（含細(xì)胞）小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液加入100微升清理液（ReagentA）到細(xì)胞樣品孔里加入100微升飽和液（ReagentD）到最大對照孔里加入100微升陰性液（ReagentE）到空白對照孔里分別加入10微升染色工作液到所有孔里輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液小心加入100微升清理液（ReagentA）到細(xì)胞樣品孔里重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9和10一次放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘加入5微升裂解液（ReagentF）到最大對照孔里放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對熒光單位（relativefluorescenceunit；RFU）包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對照孔R(shí)FU340nm、空白對照孔R(shí)FU380nm、最大對照孔R(shí)FU340nm、最大對照孔R(shí)FU380nm計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度【（樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）－（空白對照孔R(shí)FU340nm/空白對照孔R(shí)FU380nm）÷（最大對照孔R(shí)FU340nm/最大對照孔R(shí)FU380nm－樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）】X（空白對照孔R(shí)FU380nm/最大對照孔R(shí)FU380nm）X140（納摩爾；解離常數(shù)）三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測1．準(zhǔn)備1個(gè)待測的細(xì)胞爬片樣品小心加上500微升清理液（ReagentA），覆蓋樣品表面小心移去樣品上的清理液（ReagentA）移取300微升清理液（ReagentA）到新的1.5毫升離心管加入30微升染色工作液，混勻小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上，覆蓋樣品表面放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照小心移去樣品上的染色工作液小心加上500微升新鮮的清理液（ReagentA）小心移去清理液（ReagentA）小心加上500微升新鮮的清理液（ReagentA）放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘小心移去清理液（ReagentA）蓋上蓋玻片即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）四、冰凍切片檢測準(zhǔn)備1個(gè)待測的冰凍切片小心加上500微升清理液（ReagentA），覆蓋切片樣品表面小心移去樣品上的清理液（ReagentA）移取300微升清理液（ReagentA）到新的1.5毫升離心管加入30微升染色工作液，混勻小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片樣品上，覆蓋樣品表面放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照小心移去切片上的染色工作液小心加上500微升新鮮的清理液（ReagentA）小心移去清理液（ReagentA）小心加上500微升新鮮的清理液（ReagentA）放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘小心移去清理液（ReagentA）蓋上蓋玻片即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（組織細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）注意事項(xiàng)本產(chǎn)品為20次（顯微鏡）或60次（酶標(biāo)板）操作操作時(shí)，須戴手套可以使用熒光分光光度儀檢測如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失，則建議使用微注射（microinjection）技術(shù)避免使用EDTA等處理樣品孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度檢測敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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