珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司

介紹

      微塑料正成為一個(gè)重大的全球環(huán)境問題。定期、有新聞價(jià)值的重大研究揭示，塑料和微塑料存在于偏遠(yuǎn)的地理位置，或作為污染物存在于不同消費(fèi)品（特別是食品和飲料）中以及海洋生物消化系統(tǒng)內(nèi)。微塑料的來源可能是初生微塑料，即專門設(shè)計(jì)或制造成小尺寸的材料，或者從較大材料開始但在環(huán)境中分解成較小碎片的次生微塑料。最初，微塑料經(jīng)定義為尺寸小于5 mm的塑料材料，但是，盡管尚未有全球公認(rèn)的定義，但該定義現(xiàn)在經(jīng)更普遍地表述為尺寸處于1 mm且小至微米水平范圍內(nèi)的塑料顆粒。

      環(huán)境中大量的塑料污染是一個(gè)看得見的重大問題，亟待解決。小尺寸的微塑料人眼并不能看到，但它對水生和海洋物種的健康有著重要影響，并且最終可能會進(jìn)入人類食物鏈。

      分析含有微塑料的環(huán)境樣品對確定其普遍性及其影響至關(guān)重要。一系列的分析技術(shù)已應(yīng)用于微塑料的分析。在所采用的技術(shù)中，紅外（IR）光譜分析，更具體而言是紅外顯微鏡，是檢測和鑒別微塑料的主要分析技術(shù)。

紅外顯微鏡的微塑料分析操作流程

從原始樣品到最終結(jié)果有幾個(gè)步驟，包括采集樣品到數(shù)據(jù)分析。所涉及的步驟可能會有所不同，這取決于樣品類型和紅外（IR）分析制備樣品所需的樣品凈化量。工作流程如表1

所示。

表1.微塑料分析操作流程所涉及的步驟。

     不同來源的樣品和不同類型的樣品都需要對其微塑料的含量進(jìn)行分析。不同的樣品在采集和凈化方面均有其自身的復(fù)雜性。例如，瓶裝水中微塑料的分析無需對樣品凈化，而只需進(jìn)行簡單的過濾即可分析。而污水或動物攝入的微塑料則需花費(fèi)幾天時(shí)間去凈化樣品，消解其他有機(jī)材料，從而對微塑料進(jìn)行“潔凈”分析。

樣品采集

以下對不同來源的樣品所采取的采樣策略做簡要概述。

水采樣

      小溪、河流到湖泊、遠(yuǎn)海等多種不同水環(huán)境含有微塑料。此外，據(jù)悉來自水處理廠的水也含有微塑料。采樣要求之間存在相似之處，因?yàn)橐杉枇椒秶鷥?nèi)的所有微塑料，并且了解水樣的體積也非常重要。采用一致的采樣策略，可確定微塑料的數(shù)量和/或質(zhì)量隨著時(shí)間的推移呈增加還是減少趨勢。

      樣品采集對海水和淡水具有不同的要求，這主要是因?yàn)樗芏炔煌?。大多?shù)合成高分子材料的密度低于海水，這意味著微塑料一般漂浮在水面上，但是許多高分子類型材料都會沉沒在淡水系統(tǒng)中。用于采集海水表面樣品的典型設(shè)備是一個(gè)拖于船后的已知網(wǎng)目尺寸的曼塔拖網(wǎng)。對于水層面下的樣品，則采用合適的浮游生物采集網(wǎng)。這種方法也適用于湖泊和水灣。網(wǎng)目尺寸是一個(gè)重要的參數(shù)，因?yàn)樘〉木W(wǎng)目會導(dǎo)致網(wǎng)在樣品采集過程中受到相當(dāng)快的阻塞。樣品采集的體積和面積可通過使用流量計(jì)以及根據(jù)網(wǎng)的入口尺寸和采集過程中移動的距離得以確定。為測試河流水，通常將網(wǎng)懸掛于河流中的一個(gè)固定點(diǎn)，并且網(wǎng)的位置可得到設(shè)置或調(diào)整，以便在水面上或水面下的固定深度進(jìn)行采集。

沉積物采樣

      在許多情況下，可在沉積物樣品（例如在海灘或河岸上）的表面上觀察到（微）塑料。在這種情況下，在分析前可易于對樣品進(jìn)行提取和清理。但是，微塑料存在于沉積物的更深層處，因此需要采用一種采樣策略。通常采集已知質(zhì)量或體積的沉積物，并確定每單位體積顆粒的質(zhì)量或數(shù)量。沉積物樣品可采集自海床、湖泊或河床，或者在潮汐或河流水位降低時(shí)采集自海灘或河岸。沉積物樣品需要進(jìn)一步的樣品凈化以便提取微塑料用于分析，下文將對該過程做介紹。

動物攝入的塑料采樣

     據(jù)悉，塑料和微塑料存在于多種海鳥和海洋生物的胃中，且通常會導(dǎo)致死亡。1較大的塑料材料可從生物的解剖胃中物理提取而得，其在分析前需進(jìn)行清理。為確定包括微塑料在內(nèi)的塑料總量，有必要在分析前通過消解完全去除生物材料。下文將對消解的各種方法作討論。消解過程會留下塑料材料并且有望去除所有其他材料。

家用品和日用消費(fèi)品采樣

     在家庭中有幾種微塑料被釋放到排水系統(tǒng)中。眾所周知，洗衣機(jī)在清洗的過程中會產(chǎn)生成千上萬的纖維。2此外，盡管根據(jù)不同國家和地區(qū)的立法，塑料微珠的使用正在逐步淘汰，但是許多日用消費(fèi)品和化妝品（例如牙膏和沐浴露）均含有塑料微珠成分。來自家用品的微塑料的采樣可通過在洗衣機(jī)的出水口或排水系統(tǒng)的出水口上安裝具有合適網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)得以完成。就去角質(zhì)劑和身體磨砂膏而言，其大多數(shù)成分具有水溶性，因此在過濾前，將樣品與開水混合通常能去除微塑料之外的所有物質(zhì)。3

樣品凈化

      為從紅外顯微鏡分析中獲得最佳結(jié)果，必須確保樣品潔凈且無任何干擾物質(zhì)（例如生物基質(zhì)）。以下是紅外分析前用于樣品凈化所采用的不同方法的簡要概述。

密度分離法（漂?。?/p>

      塑料具有多種密度范圍，因此一些塑料會漂浮在淡水或海水中，而另一些則會沉沒。這種漂浮原理可用于將塑料材料與密度通常較高的其他物質(zhì)（例如沉積物）分離。通過將樣品與（密度較高的）飽和鹽溶液混合，可擴(kuò)大漂浮的塑料材料的范圍，并且可從液體的上層部分去除塑料。

      塑料的密度范圍大約從0.9g/cm3（聚丙烯（PP）和低密度聚乙烯（LDPE））至1.4g/ cm3（聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚氯乙烯（PVC））不等。4

      因此對于典型密度為1-1.05g/cm3的淡水或海水樣品，PP和LDPE將通過漂浮從密度顯著較高的沙子或沉積物中分離出來。

      已采用一系列將溶液密度最大化的飽和鹽溶液，以便使更多種范圍的塑料材料得以漂浮。5,6,7采用了密度為1.2-1.8g/cm3的氯化鈉、溴化物和碘化物以及密度為1.7g/cm3的氯化鋅。分離過程包括攪拌樣品，通常是沉淀物樣品，并使溶液沉降。然后取溶液的上清液過濾后分析。

樣品消解

      樣品消解的目的是去除會干擾微塑料分析但不會影響微塑料本身的生物、無機(jī)或有機(jī)材料。根據(jù)樣品基質(zhì)，可采用一系列不同的樣品消解技術(shù)。用于消解的材料可具有酸性、堿性、氧化性或酶促性。8,9,10對于酸性消解，采用的是熱硝酸，但是這將導(dǎo)致一些高分子類型材料降解。10%的氫氧化鉀溶液已作為基底物。經(jīng)證明，處于30-40%范圍內(nèi)的過氧化氫溶液具有有效性。但是，消解可能較緩慢，其需要耗費(fèi)幾天時(shí)間才可完成。采用蛋白酶K作為酶消解具有有效性。這種處理速度顯著加快，并且在50℃下兩小時(shí)的消解可從樣品中去除大量生物材料并且不會降解塑料本身。

過濾

      在一些樣品類型中，過濾是指從樣品基質(zhì)中分離出所需的微塑料（例如瓶裝水中微塑料的采集和測量）。在許多情況下，過濾是樣品凈化過程后的附加步驟。過濾過程需要符合分析的要求，并且可用作樣品凈化步驟。使用不同網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)可以將塑料收集調(diào)整到分析技術(shù)所需的樣品尺寸大小。例如，最初采用大的網(wǎng)目尺寸可過濾掉存在的較大塑料或者可去除其他較大的碎片，以便防止過濾器堵塞。微塑料可受到較小網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)或?yàn)V膜的截留。采用標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜儀易于分析較大的塑料。但是，紅外顯微鏡更常用于微塑料的分析。在某些情況下，對篩網(wǎng)上采集的微塑料所作的紅外顯微鏡分析可直接在篩網(wǎng)上進(jìn)行。3過濾過程的優(yōu)化將在后面進(jìn)行描述。

用于紅外分析的樣品制備

      紅外光譜分析是識別和鑒定高分子材料的主要分析技術(shù)。材料的紅外光譜為該材料提供唯一的“指紋”，并且可與大量的光譜庫作比較以進(jìn)行正確識別。采用標(biāo)準(zhǔn)的紅外光譜儀器和衰減全反射（ATR）采樣技術(shù)易于測量尺寸不小于100微米左右的微塑料纖維和顆粒。小型便攜式紅外光譜儀器（圖1）可攜帶至船上，以便立即識別采集的樣品。11

      對于利用ATR進(jìn)行測量的較大樣品，通常無需樣品制備。將樣品直接置于ATR附件上，采用壓力臂施加壓力并掃描樣品。但是，應(yīng)注意的是，在環(huán)境中存在了相當(dāng)長時(shí)間的塑料已風(fēng)化，并且其表面可能覆有生物膜。ATR是一種表面技術(shù)。因此，在這種情況下，建議將塑料樣品切片并測量樣品的內(nèi)部體積而非受損/受包覆表面。

       紅外顯微鏡或紅外成像系統(tǒng)可用于測量更小的顆粒。為從此類技術(shù)中獲得最佳結(jié)果，必須將微塑料從樣品基質(zhì)中分離出來。上述樣品采集和樣品凈化的介紹中已對該方法作出討論。但是，具體操作步驟可針對紅外顯微鏡進(jìn)行優(yōu)化。

圖1.具有ATR采樣模塊的Spectrum Two紅外光譜儀。

優(yōu)化紅外顯微鏡分析的過濾過程

      樣品過濾會將微塑料分離至合適的基底上用于分析。濾膜具有多種尺寸、過濾材質(zhì)和孔徑尺寸，以便優(yōu)化過濾過程。某些過濾材料在光譜的紅外線區(qū)域內(nèi)具有顯著的吸附作用，并且這些材料將掩蓋因感興趣的顆粒引起的吸附。因此，采用最合適的過濾材料極其重要。一系列不同的濾膜類型和尺寸已得以評價(jià)，以便為紅外顯微鏡的微塑料分析確定最佳濾膜類型（表2）。

表2.評估一系列不同的濾膜與顯微紅外測試的適用性

      濾膜直徑將影響樣品容量和過濾能力并且應(yīng)保持具有合理的尺寸，以便減少紅外成像所需的時(shí)間?？讖綄Q定待截留的最小粒徑，但該尺寸不能易受某些樣品基質(zhì)堵塞。對于與紅外分析之間的兼容性，（歸因于紅外分析的近似衍射極限）顆粒需大于1.5微米，并且濾膜的可用光譜范圍極其重要。每個(gè)濾膜的相對成本可能非常重要，但是對于樣品凈化可能耗費(fèi)幾小時(shí)或幾天時(shí)間的樣品，濾膜的成本就并非十分重要。對于樣品處理量較高的實(shí)驗(yàn)室，這應(yīng)該是一個(gè)重要的考慮因素。

      下文將對紅外顯微鏡的采樣模式作更詳細(xì)的討論，但是對于濾膜上的顆粒分析，其選擇通常受限于透射或反射。在進(jìn)行多種顆粒的自動測量時(shí)可使用ATR，但是樣品容易受到交叉污染。濾膜類型需要在透射或反射模式下對紅外光不出現(xiàn)任何顯著的吸收。表1所示是記錄了濾膜的紅外透射和反射光譜，并確定每種類型的可用范圍。圖2a所示為透射模式總結(jié)，而圖2b所示為反射模式總結(jié)。

      鍍金聚碳酸酯濾膜具有極好的反射能量，但無透射能量，而PVDF濾膜在透射和反射模式下均顯示出顯著的吸收帶，因此不合適。

      建議使用硅濾膜進(jìn)行透射分析，并使用硅、銀膜或鍍金聚碳酸酯進(jìn)行反射分析。

      硅的唯一缺點(diǎn)是相對成本較高以及不是標(biāo)準(zhǔn)過濾系統(tǒng)所直接兼容的尺寸，屬于“非標(biāo)準(zhǔn)”尺寸（矩形尺寸）。

圖2a和2b。不同濾膜類型的透射和反射范圍。

兩種不同濾膜類型的示例光譜如圖3所示。

圖3.不同類型濾膜的透射和反射范圍。

顯微紅外分析

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圖4.PerkinElmer Spotlight 400紅外成像系統(tǒng)

采樣模式

      采用紅外測量常規(guī)樣品的原則，使用顯微紅外對微塑料樣品進(jìn)行測量。采樣模式是透射、反射或ATR。相同的優(yōu)勢和不足之處同樣適用于顯微紅外。

1.透射

      為在透射模式下測量樣品，樣品應(yīng)置于合適的紅外透射基底上。樣品厚度通常應(yīng)小于50微米，以免達(dá)到吸收飽和。如果分析包含少量顆粒，且可能“挑選”顆粒，則最好的方法是將顆粒定位于顯微鏡樣品載物架的13mm KBr窗片上。如此可確保分離顆粒，并將采集到顆粒的純光譜。如果顆粒厚度大于50微米，則可將樣品置于微型金剛石壓池中，壓至更薄的尺寸，可以在顯微鏡臺上進(jìn)行透射測量。但是，在大多數(shù)情況下，即使使用顯微鏡工具，樣品也顯得太厚或不容易分離。如前所述，可使用合適的紅外透射模式的濾膜，而無需制備樣品或?qū)㈩w粒移除至其他基底上。另外，在大多數(shù)情況下，某些顆粒的尺寸小于50微米，而另一些則更大。去除大量顆粒的過程耗時(shí)長且困難。

2.反射

      當(dāng)分析目的是定性樣品時(shí)，通常不在本體聚合物上進(jìn)行反射測量（直接鏡面反射法）。所獲得的光譜將包含混合的光譜成分，即表面反射和透射/反射成分。此類成分會導(dǎo)致光譜失真，特別是光譜的較強(qiáng)波段，并會干擾光譜庫的搜索過程。但是，透射/反射成分通常可能是主要的光譜貢獻(xiàn)，并產(chǎn)生可識別的光譜。當(dāng)紅外光束照射到樣品時(shí)，一些光束將直接反射離開樣品表面，其余光束將進(jìn)入（透射）或穿過樣品。如果將樣品置于高反射基底上，如金反射鏡或反射濾膜，則光束將反射離開該基底并回穿樣品，從而有效地提供雙重透射。因此，從反射測量中可獲得優(yōu)質(zhì)的光譜，但是，最強(qiáng)波段可能非常強(qiáng)。對于有一定厚度的樣品，反射比透射效果好。

3. ATR

      ATR已成為在FT-IR儀器上簡單測量和識別樣品的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)無需制備樣品，并且可作用于一系列不同的樣品尺寸，包括在透射或反射方面不起作用的厚度過大的樣品。這是一種表面測試技術(shù)，因此，所獲得的光譜是材料表面的光譜，而非體積光譜。此外，所測量的有效樣品厚度處于1或2微米的范圍內(nèi)，這導(dǎo)致紅外光譜較弱。但是，所獲得的光譜強(qiáng)度足以識別材料或材料的主要成分。顯微紅外可配備微型ATR晶體，以對微粒進(jìn)行自動ATR測量。如果樣品位于堅(jiān)硬的固體基底上，如金反射鏡、窗口材料或顯微鏡載玻片，并且含有非常少量的顆粒，則在每次測量/顆粒之后，只要清潔ATR晶體，ATR即可成為一種可使用的技術(shù)。ATR的測試原則是基底與ATR晶體之間的對樣品的壓縮。在測量之后即釋放壓力時(shí)，樣品經(jīng)常留在ATR晶體上，而并非回到基底上。因此，如果在不清潔晶體的情況下測量多個(gè)顆粒，交叉污染將是一個(gè)主要問題。因此，通常不采用顯微ATR采樣模式。

      在ATR成像中，表面明顯較大的ATR晶體與樣品接觸，并在整個(gè)晶體表面上進(jìn)行ATR測量。

顯微紅外的測量模式

      紅外顯微鏡能夠測量單個(gè)微觀粒子，但其還有一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)，即能夠以全自動模式運(yùn)行來測量樣品中的多個(gè)顆粒，也能夠?qū)φ麄€(gè)樣品（如完整的濾膜）進(jìn)行繪圖（map）或成像（image）。自動化應(yīng)用于每種前述的不同的采樣模式。顯微鏡還配有可視攝像機(jī)，以允許操作員查看其正在使用的樣品，并設(shè)置位置進(jìn)行分析。

點(diǎn)模式

      在點(diǎn)模式下，軟件允許用戶選擇一個(gè)或多個(gè)對應(yīng)于顆粒的測量位置。然后，紅外顯微鏡將驅(qū)動載物臺至測量位置，以進(jìn)行掃描，然后移動至下一個(gè)樣品位置。如果樣品含有少量顆粒，則上述方法可能是一種非?？斓墓庾V收集方法。對于每個(gè)位置，軟件控制的光闌大小應(yīng)可視地包圍顆粒，以避免雜散光。與標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜測量一樣，需采用合適的背景掃描，并且應(yīng)使用與樣品掃描相同的孔徑尺寸在紅外顯微鏡上來執(zhí)行。對于透射，應(yīng)在無樣品的空白區(qū)中測量背景。對于反射，應(yīng)在反射基底的空白區(qū)中記錄背景。對于ATR，應(yīng)使用干凈的晶體來測量背景。

      軟件內(nèi)的顆粒檢測算法能夠分析可見圖像來發(fā)現(xiàn)樣品內(nèi)顆粒的存在。然后，軟件將自動掃描所有顆粒和適當(dāng)背景的光譜。相對于手動選擇分析位置，該方法具有顯著的速度優(yōu)勢，或者，如果對整個(gè)樣品進(jìn)行繪圖或成像，則可節(jié)省大量時(shí)間。圖5所示為顆粒識別工具。

圖5.分析圖像發(fā)現(xiàn)存在的顆粒。

繪圖（Mapping）

     Mapping實(shí)驗(yàn)涉及定義待測量的樣品面積（這可能是幾毫米），以及定義整個(gè)樣品上測量的X、Y間距。例如，如果樣品為0.7 mm×1 mm，并且應(yīng)每100微米進(jìn)行一次測量，則Mapping實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行70次測量（7×10）。在每個(gè)點(diǎn)上收集紅外光譜，并在整個(gè)面積上生成樣品的紅外圖。

      Mapping實(shí)驗(yàn)利用紅外顯微鏡中存在的單點(diǎn)檢測器（通常是MCT檢測器），并將測量單個(gè)光譜、移動載物臺、測量光譜，移動載物臺。對于小樣本區(qū)域或大XY間距，這已足夠。但是，對于大樣本區(qū)域（如濾膜），或測量小XY間距的非常小的顆粒，Mapping實(shí)驗(yàn)可能非常慢，并且需要很長時(shí)間。

成像（Imaging）

      成像Imaging實(shí)驗(yàn)類似于繪圖Mapping實(shí)驗(yàn)，不同之處在于成像實(shí)驗(yàn)使用具有元件陣列的檢測器同時(shí)測量多個(gè)點(diǎn),而非單個(gè)檢測器元件，導(dǎo)致整體測量速度顯著加快。陣列檢測器可能是線性陣列或焦平面陣列。線性陣列具有幾何形狀n×1，其中n通常為16或32，而焦平面陣列具有幾何形狀n×n，其中n通常為16、64或128。焦平面陣列檢測器的價(jià)格較高，并且其光譜截止值約為s/b 950 cm -1，以致于忽略某些重要的光譜信息，而線性陣列檢測器具有低至s/b 600 cm -1的完整MCT光譜范圍。

圖6. Mapping實(shí)驗(yàn)收集一行數(shù)據(jù)點(diǎn)，然后移動至下一行，直至完成為止。

圖7a和7b.（a）線性陣列檢測器收集一“列”數(shù)據(jù)點(diǎn)，然后移動至下一“列”。（b）焦平面陣列檢測器在一次測量中收集數(shù)列和數(shù)行數(shù)據(jù)點(diǎn)。

紅外成像的一個(gè)示例如圖8所示。

圖8.從化妝品配方中過濾的微塑料顆粒的總紅外吸光度圖像。

      在紅外圖像中的每個(gè)像素均有與之相關(guān)的完整的紅外光譜。在點(diǎn)模式下工作時(shí)，系統(tǒng)將每個(gè)顆粒生成一個(gè)光譜。在圖像模式下工作時(shí)，系統(tǒng)將每像素生成1個(gè)光譜，從而導(dǎo)致每次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)。例如，以6.25μm像素大小測量的10 mm×10 mm圖像將包含超過250萬個(gè)光譜。軟件的各種處理工具均考慮到簡化數(shù)據(jù)解析步驟，最強(qiáng)大的是主成分分析（PCA）。在PerkinElmer光譜圖像軟件中，該分析法通過選Show Structure功能得以引用。該功能將使用PCA在樣品內(nèi)尋找不同的化學(xué)組分。不同的PCA組分將表示存在的不同材料，并針對不同組分生成圖像，以指示樣品內(nèi)不同材料的分布位置。圖9a-d所示為一個(gè)示例

圖9a-d.（a）總吸光度紅外圖像。（b）顯示混合組分的PCA分析。不同的組分采用不同的顏色，以區(qū)分不同的化學(xué)成分類型。（c）2組分圖像。（d）4組分圖像。

圖10.觀察到的顆粒光譜；組分4的圖像即聚乙烯（頂部），以及組分2的圖像即聚丙烯（底部）。

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