凝膠種類及性質(zhì)

（一）聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。即丙烯酰胺和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺，在催化劑過(guò)硫酸銨作用下聚合形成凝膠。

聚丙烯酰胺（PAM，polyacrylamide）

聚丙烯酰胺簡(jiǎn)稱PAM，分子量100～500萬(wàn)。聚丙烯酰胺主要有兩種商品形式，一種是粉末狀的，另一種是膠體，還有聚丙烯酰胺乳液 (上海合成樹(shù)脂研究所研制) 。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺當(dāng)濃度超過(guò)10％以后．就會(huì)形成凝膠狀結(jié)構(gòu)。提高溫度可以稍微促進(jìn)溶解，但溫度不得超過(guò)50℃，以防發(fā)生分子降解。難溶于有機(jī)溶劑。溫度超過(guò)120 ℃時(shí)分解。中性，無(wú)毒。用作增稠劑、絮凝劑、減阻劑，具有凝膠、沉降、補(bǔ)強(qiáng)等作用。貯存于陰涼、通風(fēng)、干燥的庫(kù)房?jī)?nèi)，防潮、避光、防熱。存放時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

（二）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）

⑴ Sephadex G 交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

⑵ Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。

（三）瓊脂糖凝膠

瓊脂糖 Agarose，縮寫為 AG，是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份，也譯為瓊膠素或瓊膠糖。瓊膠糖化學(xué)結(jié)構(gòu)由β-D-吡喃半乳糖 (1-4) 連接3,6-脫水α-L-吡喃半乳糖基單位構(gòu)成。

把瓊脂糖，即幾乎不含硫酸根的主要成分為多糖的瓊脂，溶于熱水，冷卻制成的凝膠。制成的小顆粒用于凝膠過(guò)濾。適于用sephadex不能分級(jí)分離的大分子的凝膠過(guò)濾，若使用5％以下濃度的凝膠，也能夠分級(jí)分離細(xì)胞顆粒、病毒等。利用其吸附性小的特點(diǎn)，有時(shí)用它代替瓊脂、以作為免疫電泳或凝膠內(nèi)沉降反應(yīng)的支持物。

瓊脂糖凝膠商品名很多，常見(jiàn)的有:

凝膠色譜柱Sepharose （瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國(guó)，Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來(lái)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開(kāi)始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。

（四）聚苯乙烯凝膠

商品為Styrogel，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。

填料合成技術(shù)

凝膠色譜填料合成技術(shù)的進(jìn)展主要在下面四個(gè)方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的發(fā)展。近年來(lái)在這方面有較多的新產(chǎn)品，中國(guó)也有許多單位在研制和生產(chǎn)。高效凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的應(yīng)用面。

四種多孔硅膠的理論塔板數(shù) 

高效色譜柱除了對(duì)填料的粒度有要求外，對(duì)粒度分布也要求相當(dāng)窄。用一般的制備方法往往得到粒度較寬的產(chǎn)品，需要進(jìn)一步過(guò)篩。當(dāng)填料的粒度在30微米以下時(shí)，這種過(guò)篩非常困難，已經(jīng)成為填料制備上一個(gè)較大的技術(shù)難關(guān)。Kirkland，最近利用了尿素和甲醛在酸性介質(zhì)中形成大小均勻的液體高聚物，加入某種硅溶膠時(shí)，硅溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。最后把有機(jī)高聚物灼燒掉后就能得到由微粒硅珠堆積而成的多孔填料。這種堆積硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔徑?jīng)Q定于原始硅溶膠的規(guī)格，用不同的硅膠就可以制得不同孔徑的填料。柴志寬等則利用一種硅膠制成粒度分布窄的填料后，再利用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)孔方法以得到各種孔徑的填料。從這些方法制得的微球填料，粒度分布可以達(dá)到相當(dāng)窄，所以可以不經(jīng)篩選直接使用。

用GPC和GPC-LALLS得到PS標(biāo)樣分子量比較 

隨著進(jìn)樣技術(shù)和色譜柱接頭設(shè)計(jì)的改進(jìn)，現(xiàn)在已經(jīng)可以得到柱效每米在八萬(wàn)到十萬(wàn)的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球硅膠裝填色譜柱，都能達(dá)到每米八萬(wàn)到十萬(wàn)塊塔板數(shù)的高效。他用這種色譜柱有效地進(jìn)行了案件偵查中所要求的分析問(wèn)題。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

（一）層析柱

凝膠滲透色譜儀 

層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞，一般不超過(guò)1米。分族分離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比較5：1─10：1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20：1─100：1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時(shí)，死體積不能超過(guò)總床體積的1/1000。

（二）凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的Sephadex G-200效果好，脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（三）凝膠的制備

商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)，自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。

（四）樣品溶液的處理

樣品溶液如有沉淀應(yīng)過(guò)濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過(guò)Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過(guò)4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。