凝膠色譜法

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。GFC一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目的。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對勿子質(zhì)量分布測試。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。

凝膠色譜法分類

根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠過濾色譜:

凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜:

凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。

凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。

近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目的。

凝膠色譜法原理

凝膠色譜法又稱體積排阻色譜法，使用水溶液流動相的稱為凝膠過濾色譜，使用有機(jī)溶劑流動相的稱為凝膠滲透色譜。凝膠色譜的固定相是多孔物質(zhì)，如多孔凝膠、交聯(lián)聚苯乙烯、多孔玻璃及多孔硅膠等。試樣是按照其中各組分分子大小的不同而分離的。大于填料微孔的分子，由于不能進(jìn)入填料微孔，而直接通過柱子，最先流出柱外，在色譜圖上最早出現(xiàn)，小于填料微孔的組分分子，可以滲透到微孔中不同的深度，相對分子質(zhì)量最小的組分，保留時間最長。

凝膠色譜法原理示意圖

凝膠色譜與凝膠層析是否一樣？

基本上是一致的只是固定相存在差異。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。

兩者的共同點(diǎn)是都不需要有機(jī)溶劑。凝膠色譜色譜一般用在HPLC等分析場合。而凝膠層析一般用在制備的時候。

凝膠滲透色譜與高效液相色譜有什么區(qū)別？

凝膠色譜是高效液相色譜的一種。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography\HPLC）又稱“高壓液相色譜”，是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。分類有反相色譜法，正相色譜法，分子排阻色潽法等。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。高效凝膠色譜法即用現(xiàn)代高效液相色譜法所使用的高壓流路系統(tǒng)，將分離凝膠裝填到金屬色譜柱中形成封閉液相系統(tǒng)進(jìn)行分離的色譜法。實際上凝膠色譜在本質(zhì)上就是液相色譜，只不過其分離原理是用凝膠對分子大小的排阻，而不是常規(guī)液相色譜法常用的利用物質(zhì)極性。

凝膠色譜法和電泳的區(qū)別是什么？

凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。分離依據(jù)是目的物分子量的大小。主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。形象來說更像是“分子篩”。大分子物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。

凝膠電泳的原理比較簡單。當(dāng)一種分子被放置在電場當(dāng)中時，它們就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。它同電場的強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說，電場強(qiáng)度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等，從而降低了對流運(yùn)動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)成或形狀的差異，以及所帶的凈電荷的多少，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。形象來說更像是“馬拉松”。不過影響因素不僅僅是分子量了。

凝膠凈化柱和凝膠色譜柱是一回事嗎?

原理是一回事，都是排阻色譜。  但是前者是制備柱，對大量樣品進(jìn)行分離，柱子口徑大，一般要有切割承樣的尾接裝置；后者是分析柱，主要目的是對小量樣品進(jìn)行分析，柱子直徑小，一般還有柱溫箱，對泵的穩(wěn)定性要求高，必須接檢測器。

什么是凝膠？

膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體（在干凝膠中也可以是氣體，干凝膠也稱為氣凝膠），這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內(nèi)部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達(dá)99%以上?？煞譃閺椥阅z和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當(dāng)重新吸收分散介質(zhì)時，體積又重新膨脹，例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質(zhì)時，形狀和體積都不改變，例如硅膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過程稱為膠凝作用（gelation）。

凝膠色譜法的凝膠種類及性質(zhì)

⑴Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克干膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:

⑴疊氨鈉（NaN3）

在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉

在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽

在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果最佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。