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PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作及步驟——中國(guó)生物器材網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-07-25  來(lái)源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):747
步驟構(gòu)成: ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備; ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合; ③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在酶的作用下,以P為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的 半保留復(fù)制鏈 ,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
實(shí)驗(yàn)試劑與器材: 模板DNA、2.5mmol/L q DNA聚合酶(5U/SSR引物 10 buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O PCR儀、移液槍、PCR板 實(shí)驗(yàn)步驟:
一、實(shí)驗(yàn)器具與材料: 1、移液槍:1ml、200 l、20 l、10 l、2 l 2、吸頭:1ml、200 l、20 l 3、勻漿管:5ml 4、吸頭臺(tái):放置1ml吸頭的一個(gè),放置20 l吸頭的一個(gè) 5、EP管:1.5ml、0.2ml、100 l 6、試劑瓶:2個(gè)60ml的棕色試劑瓶(廣口,帶蓋) 1個(gè)125ml的白色試劑瓶(放無(wú)水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、試管架:5ml、1.5ml、20 l 10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個(gè)備用,一個(gè)裝無(wú)水乙醇,另一個(gè)裝DEPC水 11、鋁制飯盒:4個(gè) 12、塑料小飯盒:1個(gè) 13、大瓷缸:2個(gè) 14、錫泊紙:一卷 15、卷紙:2卷 16、三角燒瓶:帶蓋,稍大 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備:
1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等) 先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個(gè)浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過(guò)夜,然后高壓,再烤干備用,實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái),再高壓一次(EP管) 2、玻璃制品:泡酸過(guò)夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1 DEPC過(guò)夜,再烤干) 3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC) 試劑配制: 1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1 DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。 2、75%乙醇:用無(wú)水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓) 3、異丙醇:放入棕色瓶中 4:放入棕色瓶中 5、瓊脂糖
 
關(guān)鍵詞: 引物 吸頭 模板 勻漿 乙醇
 
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