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基于Wes建立蛋白類藥物活性成分檢測方法——中國生物器材網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-07-22  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):717

隨著生物藥品的迅速發(fā)展,研究人員將面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)任務(wù)是開發(fā)一種可靠、耐用和高效的檢測方法,以在體外和體內(nèi)檢測和量化有效的生物藥品成分。

最常用的方法包括經(jīng)典配體結(jié)合測定(LBAS)、LC-MS的測定,以及新出現(xiàn)的LBA-LC-MS混合技術(shù)。LC-MS和LBA-LC-MS是一個技術(shù)先進(jìn)的方法,但是操作復(fù)雜,周期長,通量低,成本高,不適合于快速篩選和早期開發(fā)研究大樣本量的實(shí)際需求。

對于LBAS而言,ELISA是最常用的用于定量目的的方法。雖然在技術(shù)上要求較低并且成本低,但它高度特異性的抗體對,但是新的重組肽或蛋白質(zhì)通常是不容易拿到高質(zhì)量的抗體對。篩選可用的抗體對是耗時和費(fèi)力的,涉及昂貴的純化步驟,并且依賴于使用的動物。另外,抗體可能無法檢測所有重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體變體。

另一種常見的LBA是傳統(tǒng)的Western印跡法,但是無法準(zhǔn)確定量,操作繁瑣,不穩(wěn)定,不符合生物藥品準(zhǔn)確性,耐用性和穩(wěn)定性的要求。

基于Wes建立生物藥品活性成分檢測方法

(體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥物代謝動力學(xué))

俄亥俄州立大學(xué)藥學(xué)院的科學(xué)家,基于ProteinSimple的Wes定量Western blot技術(shù)開發(fā)了一種新的,高效,高靈敏度的定量工具,以支持治療性重組蛋白的早期開發(fā),避免上述限制。

An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system,Bioanalysis,Published online:20 March 2019。

簡述:本研究使用的重組蛋白,分子量約為55kDa,N端6X-His-標(biāo)記,C末端DYKDDDDK(FLAG)??贵w:生物素化的抗Flag抗體,鏈霉親和素-HRP。Wes單次可以檢測25個樣品,在從樣品處理開始到數(shù)據(jù)采集的6小時內(nèi)(Wes操作及檢測時間約為3.5小時).

LLOQ為0.4nM(20ng/mL)。作者基于該平臺完成了一個方法開發(fā)快,高效的,檢測速度快的重組蛋白類藥物的體外穩(wěn)定性研究和藥代動力學(xué)(PK)研究的技術(shù)平臺,且無需產(chǎn)生特異性單克隆抗體。該方法也消除了目標(biāo)蛋白富集步驟,富集可能引入顯著的樣本間變異性。

Wes自動化的免疫測定平臺,基于毛細(xì)管電泳技術(shù),整合了免疫學(xué)檢測方法。

在生物制藥領(lǐng)域具有一系列獨(dú)特優(yōu)勢

1. 全程自動化

2. 精密度高

3. 耐用性好

4. 靈敏度高

5. 準(zhǔn)確定量
 

部分結(jié)果

精密度

體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)(PK)實(shí)驗(yàn)

作者文章總結(jié)
Development and validation of a reliable, robust and efficient assay to detect and quantifymacromolecules in vitro and in vivo during the early stage of a biotherapeutic agent discovery remain a major challenge for researchers, especially in the academia setting where resources can be limited.
A simple (enrichment-free), highly sensitive and efficient immunoassay using a capillary-based western system to assess the in vitro stability and pharmacokinetic properties of propitious epitope-tagged recombinant proteins in vivo in mouse to support an early stage development of a lead therapeutic recombinant protein.
The method validation results demonstrated satisfactory characteristics in specificity, linearity, accuracy and precision.
This protocol avoids the need of laborious and costly customized monoclonal antibody as is typically essential for an ELISA or multistep enrichment process which are often indispensable when employing a liquid chromatography mass spectrometry-based method.
The protocol is capable of quantifying up to 25 samples at the dynamic concentration range from 5 to 200 ng/ml with an LLOQ of the target protein at 0.4 nM (20 ng/ml).

方法學(xué)的優(yōu)化,請閱讀文章原文

 
關(guān)鍵詞: 抗體 定量 重組 體外 檢測
 
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