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評估RNA 完整性是獲得有意義基因表達數(shù)據(jù)的第一個關鍵步驟。采用完整RNA 是成功微陣列或 qRT-PCR 分析的關鍵要素。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)和 RNA 試劑盒在協(xié)助研究者確定 RNA 質量方面發(fā)揮重要作用。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上生成的譜圖包括濃度信息，允許直觀檢查RNA 完整性，并生成核糖體比率。本應用簡報描述的新軟件算法開發(fā)用于從生物分析儀電泳圖提取RNA 樣品完整性的信息。
前言
確定RNA 起始材料的完整性是基因表達分析中的一個關鍵步驟。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)及相關的 RNA 6000 Nano 試劑盒和 Pico 試劑盒已成為RNA 質量評估和定量的標準1,2。在精密加工的芯片上利用電泳分離，分離RNA 樣品，并隨后通過激光誘導熒光檢測法檢測。生物分析儀軟件生成電泳圖和凝膠樣圖像，并展示多種結果，如樣品濃度和核糖體比率。電泳圖提供了RNA 樣品質量的詳細直觀評估結果。然而，依賴人工目視解釋數(shù)據(jù)的方 法具有內在缺陷。此前，研究者們 已經(jīng)將核糖體比率在平板凝膠分析 中并作為特征在生物分析儀軟件中 用來表征RNA 完整性的狀態(tài)。采用核糖體比率的總RNA 樣品平板凝膠分析通常得到不準確的RNA 完整性評估結果3。通過顯示 RNA 片段大小分布的詳細畫面，Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)提供更好的RNA 完整性評估結果。
圖 1
總RNA 樣品經(jīng)過不同時間降解，并且在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上使用真核細胞總RNA Nano 分析法分析所得的樣品。隨著降解推進，可以觀察到向較短片段大小方向偏移 RNA 降解是一個逐漸的過程。隨著降解推進（圖 1），18S/28S 核糖體條帶比減小，而兩個核糖體峰和下位內標之間的基線信號增大。生物分析儀軟件自動生成 18S/28S 核糖體亞基的比率。盡管核糖體比率在確定凝膠電泳中樣品降解程度方面發(fā)揮重要作用，但Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中更詳細的分析表明， 該比率未充分描述樣品完整性。
為了將RNA 完整性解釋過程標準化， 安捷倫科技有限公司已經(jīng)推出一種新的RNA 質量評估工具。開發(fā)RNA 完整值 (RIN) 旨在消除 RNA 質量控制中的個人解釋。它將完整電泳圖納入考量?；?1 至 10 的編號系統(tǒng)，RIN 軟件算法可將真核生物總 RNA 分類，其中 1 代表降解最嚴重的情況并且 10 代表最完整。通過這種方式，有助于解釋電泳圖，令樣品比 較成為可能，并確保實驗的重復性。
RIN 工具的開發(fā)
RIN 軟件算法針對 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中用真核生物總 RNA Nano 分析法采集的樣品開發(fā)。輸入數(shù)據(jù)包括來自三個哺乳動物物種（人類、小鼠和大鼠）的不同組織中約 1300 份總 RNA 樣品，所有樣品的完整程度各不相同。RNA 樣品的分類由應用專家手動進行，他們將每份總RNA 樣品分類至 1-10 的預定編號系統(tǒng)。圖 2 展示了不同 RIN 類別的代表性電泳圖（編號分別為10、6、3、2）。
圖2
用于調試RNA 完整值(RIN) 軟件的樣品電泳圖。樣品為完整樣品(RIN 10) 至降解樣品(RIN 2)
為開發(fā) RIN 算法，采用了神經(jīng)網(wǎng)絡等自適應學習工具（工具由Quantiom Bioinformatics 提供）。這些工具允許確定可以從電泳圖提取的關鍵特征。這些特征是可以采用
合適積分儀分析的電泳圖組成部分。它們可以是信號面積、強度、比值等。圖 3 中列出電泳圖的重要要素。他們包括不同的區(qū)域（前區(qū)、5S區(qū)、快速區(qū)、中區(qū)、前體區(qū)、后區(qū)）和峰（標準品、18S、28S）。
圖 3
詳述提示RNA 質量的各區(qū)域的電泳圖
RIN 可視化
先前版本生物分級軟件中存在的數(shù)據(jù)可以同樣存在于下一版 Expert 軟件中，例如RNA 面積、RNA 濃度和rRNA 比率。RIN 軟件包括 RIN 值（圖 4），該值可以表述為小數(shù)或整數(shù)。RIN 值可以在 全局高級 設置下的 設點瀏覽器 中的 分析性質 選項卡中從小數(shù)變?yōu)檎麛?shù)。如果軟件在某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)意外的峰或信號，可能無法計算RIN 值。
圖4
Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)Expert 軟件中的RIN 可視化。 結果 選項卡中顯示 RIN 值， 而 錯誤 選項卡將包含在RIN 未計算情況下有用的信息
這將產(chǎn)生提示已檢測到異常的錯誤 消息（列在軟件的錯誤選項卡中）。異常包括基因組DNA 污染、鬼峰、尖峰和波浪狀基線。異?？梢苑譃閮深悾宏P鍵和非關鍵。非關鍵異常（如后區(qū)的尖峰）將導致計算 RIN 值， 而關鍵異常（如快速區(qū)的尖峰）將 導致 RIN 值無法計算。如果認定某個異常非關鍵（如基因組污染，此 事應當進行DNA 酶消化以獲取有意義的數(shù)據(jù)），對于已經(jīng)標記的樣品，仍可以通過在 設點瀏覽器 的高級設置中提高異常閾值設定，計算RIN 值（圖 5）。異常閾值檢測的最大值為 1。錯誤消息的描述將與適當閾值相對應。
圖5
改變異常閾值和RIN 單位小數(shù)表示。如果分析期間已經(jīng)檢測到關鍵異常，則在許多情況下仍可以通過提高閾值（最大值為 1）計算RIN 值?？梢栽?錯誤 選項卡中找到關于異常的信息
利用RIN 得到的結果
開發(fā) RIN 軟件以消除依賴用戶的RNA 質量解釋過程?？俁NA 樣品的表征基本上與儀器、樣品濃度和操作者無關，從而允許跨不同實驗室比較樣品。
RNA 完整性
圖 6 展示三份完整程度狀態(tài)不同的RNA 樣品。RIN 工具賦予三種不同命名，代表相應的完整性。在樣品與調試算法時所用樣品不同的大型驗證研究期間，得到了可靠的樣品分類。
圖6
在完整程度不同的樣品上檢驗RNA 完整值。RIN 軟件算法能夠將樣品精確分類
核糖體比率
圖 7 顯示了在三臺不同儀器上分析
的同一份人腦 (Ambion, Inc.) 總 RNA 樣品，并且顯示了儀器 1 和儀器 3 的代表性電泳圖。將采用生物分析 儀軟件生成的核糖體比率與 RIN 值比較。對于 36 份樣品，與 RIN 值相比，采用核糖體比率時變異程度較 大。RIN 計算值的變異系數(shù)為 1.4%， 而核糖體比率的變異系數(shù)為 5.1%。謹記這些CV 值指向相同樣品。當納入來自不同物種和組織的樣品時， 發(fā)現(xiàn)核糖體比率的CV值顯著增大。
圖7
三臺不同儀器上分析 36 份總RNA 樣品。將RIN 與核糖體比率比較。RIN 工具的CV 顯著低于核糖體比率
分析不同稀釋度的樣品時，獲得了類似圖像（圖 8）。將小鼠腦總 RNA 稀釋為三個不同濃度：25 ng/ L、 100 ng/ L 和 500 ng/ L。對于測試的 108 份樣品中，RIN 值大幅度優(yōu)于核糖體比率。RIN的變異系數(shù)為3%，而核糖體比率的變異系數(shù)則為 22%。應當指出，低于 25 ng/ L時，不能獲得準確的RIN 值。對于大于 50 ng/ L 的樣品濃度，獲得最佳結果。
圖8
檢驗不同稀釋程度的同一份RNA 樣品時，以狹窄限值范圍獲得相同的RIN 值，而核糖體比率顯示重現(xiàn)性差得多
利用RIN
RIN 是測量 RNA 完整性的一款強大的新工具。圖 9 中的圖示給出了RIN 的最佳實際使用案例。作為第一步，應當驗證 RIN 值（圖 9A）。這可以通過將 RIN 值與特定下游實驗如微陣列分析或RT-PCR 關聯(lián)來進行。可以利用這個關聯(lián)步驟在成功的下游實驗和失敗的實驗間建立RIN 閾值?？梢栽诂F(xiàn)有生物分析儀數(shù)據(jù)集合（如可獲得）上進行此步驟。在已經(jīng)建立閾值后，這個值可以用 于標準RNA 質量控制程序（圖 9B）。RIN 高于閾值的所有樣品通過QC 檢驗，而丟棄RIN 低于閾值的樣品。如果重要實驗參數(shù)變更（例如，研究不同的生物、使用不同類型的微陣列、采用不同的探針集等），則應當重復驗證 RIN 的關聯(lián)步驟。截至目前，已采用真核生物總 RNA Nano 分析法檢驗RIN 算法。
圖 9
A. 將RIN 值與下游實驗（例如微陣列或RT-PCR）關聯(lián)并確定獲得有用基因表達結果的閾值
B. 在已經(jīng)進行初始關聯(lián)實驗并已經(jīng)設定數(shù)據(jù)閾值后，RIN 值可以用于丟棄在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中未通過樣品QC 的樣品（RIN 值低于閾值） RIN 局限性
RIN 旨在提供明確的 RNA 完整性評估結果。給出了樣品完整性的衡量標準，它可用于直接比較運輸前后的樣品，或用于比較不同實驗室間的樣品。最重要的是，它可以用來確保基因表達實驗的重復性，只要涉及樣品提取步驟。然而，在無前期驗證工作的情況下，RIN 不能預測基因表達數(shù)據(jù)的效能。例如，一份樣品可能過度降解而無法進行全基因組微陣列實驗，但可能產(chǎn)生良好的 RT-PCR 數(shù)據(jù)。為了有效利用RIN，必須進行必要的關聯(lián)工作。
結論
我們已經(jīng)設計出一款能夠比核糖體比率更好評估 RNA 質量的軟件算法。RIN 工具是 RNA 完整性評估標準化的重要環(huán)節(jié)。研究者不再受困于總 RNA 的主觀分類。通過進行關聯(lián)實驗，可創(chuàng)建閾值以確保實驗的重復性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) RIN 工具基本上沒有儀器變異性及濃度變異性， 因此有助于儀器間及實驗室間樣品的比較。
參考文獻
1. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribo- green analysis, and UV spectrometry （采用 Agilent 2100 生物分析儀、RiboGreen 分析試劑和紫外光譜對總RNA進行定量比較），安捷倫應用簡報，出版號 5988-7650EN, 2002
2. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantita- tion , Electrophoresis, 21(1), 128-34,
2000
3. Advancing the quality control methodology to asses isolated total RNA and generated fragmented cRNA （通過改進質量控制方法評估游離總RNA 以及生成的 cRNA 片段，安捷倫應用簡報，出版號5988-9861EN, 2003
致謝
我們要特別感謝合作伙伴 Ambion
Inc.、德國基因組研究資源中心
(RZPD) 以及 Quantiom Bioinformatics。我們還要特別感謝對 RIN 算法進行內部測試并提供寶貴意見的所有研究人員。
前言
確定RNA 起始材料的完整性是基因表達分析中的一個關鍵步驟。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)及相關的 RNA 6000 Nano 試劑盒和 Pico 試劑盒已成為RNA 質量評估和定量的標準1,2。在精密加工的芯片上利用電泳分離，分離RNA 樣品，并隨后通過激光誘導熒光檢測法檢測。生物分析儀軟件生成電泳圖和凝膠樣圖像，并展示多種結果，如樣品濃度和核糖體比率。電泳圖提供了RNA 樣品質量的詳細直觀評估結果。然而，依賴人工目視解釋數(shù)據(jù)的方 法具有內在缺陷。此前，研究者們 已經(jīng)將核糖體比率在平板凝膠分析 中并作為特征在生物分析儀軟件中 用來表征RNA 完整性的狀態(tài)。采用核糖體比率的總RNA 樣品平板凝膠分析通常得到不準確的RNA 完整性評估結果3。通過顯示 RNA 片段大小分布的詳細畫面，Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)提供更好的RNA 完整性評估結果。
圖 1
總RNA 樣品經(jīng)過不同時間降解，并且在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上使用真核細胞總RNA Nano 分析法分析所得的樣品。隨著降解推進，可以觀察到向較短片段大小方向偏移 RNA 降解是一個逐漸的過程。隨著降解推進（圖 1），18S/28S 核糖體條帶比減小，而兩個核糖體峰和下位內標之間的基線信號增大。生物分析儀軟件自動生成 18S/28S 核糖體亞基的比率。盡管核糖體比率在確定凝膠電泳中樣品降解程度方面發(fā)揮重要作用，但Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中更詳細的分析表明， 該比率未充分描述樣品完整性。
為了將RNA 完整性解釋過程標準化， 安捷倫科技有限公司已經(jīng)推出一種新的RNA 質量評估工具。開發(fā)RNA 完整值 (RIN) 旨在消除 RNA 質量控制中的個人解釋。它將完整電泳圖納入考量?；?1 至 10 的編號系統(tǒng)，RIN 軟件算法可將真核生物總 RNA 分類，其中 1 代表降解最嚴重的情況并且 10 代表最完整。通過這種方式，有助于解釋電泳圖，令樣品比 較成為可能，并確保實驗的重復性。
RIN 工具的開發(fā)
RIN 軟件算法針對 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中用真核生物總 RNA Nano 分析法采集的樣品開發(fā)。輸入數(shù)據(jù)包括來自三個哺乳動物物種（人類、小鼠和大鼠）的不同組織中約 1300 份總 RNA 樣品，所有樣品的完整程度各不相同。RNA 樣品的分類由應用專家手動進行，他們將每份總RNA 樣品分類至 1-10 的預定編號系統(tǒng)。圖 2 展示了不同 RIN 類別的代表性電泳圖（編號分別為10、6、3、2）。
圖2
用于調試RNA 完整值(RIN) 軟件的樣品電泳圖。樣品為完整樣品(RIN 10) 至降解樣品(RIN 2)
為開發(fā) RIN 算法，采用了神經(jīng)網(wǎng)絡等自適應學習工具（工具由Quantiom Bioinformatics 提供）。這些工具允許確定可以從電泳圖提取的關鍵特征。這些特征是可以采用
合適積分儀分析的電泳圖組成部分。它們可以是信號面積、強度、比值等。圖 3 中列出電泳圖的重要要素。他們包括不同的區(qū)域（前區(qū)、5S區(qū)、快速區(qū)、中區(qū)、前體區(qū)、后區(qū)）和峰（標準品、18S、28S）。
圖 3
詳述提示RNA 質量的各區(qū)域的電泳圖
RIN 可視化
先前版本生物分級軟件中存在的數(shù)據(jù)可以同樣存在于下一版 Expert 軟件中，例如RNA 面積、RNA 濃度和rRNA 比率。RIN 軟件包括 RIN 值（圖 4），該值可以表述為小數(shù)或整數(shù)。RIN 值可以在 全局高級 設置下的 設點瀏覽器 中的 分析性質 選項卡中從小數(shù)變?yōu)檎麛?shù)。如果軟件在某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)意外的峰或信號，可能無法計算RIN 值。
圖4
Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)Expert 軟件中的RIN 可視化。 結果 選項卡中顯示 RIN 值， 而 錯誤 選項卡將包含在RIN 未計算情況下有用的信息
這將產(chǎn)生提示已檢測到異常的錯誤 消息（列在軟件的錯誤選項卡中）。異常包括基因組DNA 污染、鬼峰、尖峰和波浪狀基線。異?？梢苑譃閮深悾宏P鍵和非關鍵。非關鍵異常（如后區(qū)的尖峰）將導致計算 RIN 值， 而關鍵異常（如快速區(qū)的尖峰）將 導致 RIN 值無法計算。如果認定某個異常非關鍵（如基因組污染，此 事應當進行DNA 酶消化以獲取有意義的數(shù)據(jù)），對于已經(jīng)標記的樣品，仍可以通過在 設點瀏覽器 的高級設置中提高異常閾值設定，計算RIN 值（圖 5）。異常閾值檢測的最大值為 1。錯誤消息的描述將與適當閾值相對應。
圖5
改變異常閾值和RIN 單位小數(shù)表示。如果分析期間已經(jīng)檢測到關鍵異常，則在許多情況下仍可以通過提高閾值（最大值為 1）計算RIN 值?？梢栽?錯誤 選項卡中找到關于異常的信息
利用RIN 得到的結果
開發(fā) RIN 軟件以消除依賴用戶的RNA 質量解釋過程?？俁NA 樣品的表征基本上與儀器、樣品濃度和操作者無關，從而允許跨不同實驗室比較樣品。
RNA 完整性
圖 6 展示三份完整程度狀態(tài)不同的RNA 樣品。RIN 工具賦予三種不同命名，代表相應的完整性。在樣品與調試算法時所用樣品不同的大型驗證研究期間，得到了可靠的樣品分類。
圖6
在完整程度不同的樣品上檢驗RNA 完整值。RIN 軟件算法能夠將樣品精確分類
核糖體比率
圖 7 顯示了在三臺不同儀器上分析
的同一份人腦 (Ambion, Inc.) 總 RNA 樣品，并且顯示了儀器 1 和儀器 3 的代表性電泳圖。將采用生物分析 儀軟件生成的核糖體比率與 RIN 值比較。對于 36 份樣品，與 RIN 值相比，采用核糖體比率時變異程度較 大。RIN 計算值的變異系數(shù)為 1.4%， 而核糖體比率的變異系數(shù)為 5.1%。謹記這些CV 值指向相同樣品。當納入來自不同物種和組織的樣品時， 發(fā)現(xiàn)核糖體比率的CV值顯著增大。
圖7
三臺不同儀器上分析 36 份總RNA 樣品。將RIN 與核糖體比率比較。RIN 工具的CV 顯著低于核糖體比率
分析不同稀釋度的樣品時，獲得了類似圖像（圖 8）。將小鼠腦總 RNA 稀釋為三個不同濃度：25 ng/ L、 100 ng/ L 和 500 ng/ L。對于測試的 108 份樣品中，RIN 值大幅度優(yōu)于核糖體比率。RIN的變異系數(shù)為3%，而核糖體比率的變異系數(shù)則為 22%。應當指出，低于 25 ng/ L時，不能獲得準確的RIN 值。對于大于 50 ng/ L 的樣品濃度，獲得最佳結果。
圖8
檢驗不同稀釋程度的同一份RNA 樣品時，以狹窄限值范圍獲得相同的RIN 值，而核糖體比率顯示重現(xiàn)性差得多
利用RIN
RIN 是測量 RNA 完整性的一款強大的新工具。圖 9 中的圖示給出了RIN 的最佳實際使用案例。作為第一步，應當驗證 RIN 值（圖 9A）。這可以通過將 RIN 值與特定下游實驗如微陣列分析或RT-PCR 關聯(lián)來進行。可以利用這個關聯(lián)步驟在成功的下游實驗和失敗的實驗間建立RIN 閾值?？梢栽诂F(xiàn)有生物分析儀數(shù)據(jù)集合（如可獲得）上進行此步驟。在已經(jīng)建立閾值后，這個值可以用 于標準RNA 質量控制程序（圖 9B）。RIN 高于閾值的所有樣品通過QC 檢驗，而丟棄RIN 低于閾值的樣品。如果重要實驗參數(shù)變更（例如，研究不同的生物、使用不同類型的微陣列、采用不同的探針集等），則應當重復驗證 RIN 的關聯(lián)步驟。截至目前，已采用真核生物總 RNA Nano 分析法檢驗RIN 算法。
圖 9
A. 將RIN 值與下游實驗（例如微陣列或RT-PCR）關聯(lián)并確定獲得有用基因表達結果的閾值
B. 在已經(jīng)進行初始關聯(lián)實驗并已經(jīng)設定數(shù)據(jù)閾值后，RIN 值可以用于丟棄在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中未通過樣品QC 的樣品（RIN 值低于閾值） RIN 局限性
RIN 旨在提供明確的 RNA 完整性評估結果。給出了樣品完整性的衡量標準，它可用于直接比較運輸前后的樣品，或用于比較不同實驗室間的樣品。最重要的是，它可以用來確保基因表達實驗的重復性，只要涉及樣品提取步驟。然而，在無前期驗證工作的情況下，RIN 不能預測基因表達數(shù)據(jù)的效能。例如，一份樣品可能過度降解而無法進行全基因組微陣列實驗，但可能產(chǎn)生良好的 RT-PCR 數(shù)據(jù)。為了有效利用RIN，必須進行必要的關聯(lián)工作。
結論
我們已經(jīng)設計出一款能夠比核糖體比率更好評估 RNA 質量的軟件算法。RIN 工具是 RNA 完整性評估標準化的重要環(huán)節(jié)。研究者不再受困于總 RNA 的主觀分類。通過進行關聯(lián)實驗，可創(chuàng)建閾值以確保實驗的重復性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) RIN 工具基本上沒有儀器變異性及濃度變異性， 因此有助于儀器間及實驗室間樣品的比較。
參考文獻
1. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribo- green analysis, and UV spectrometry （采用 Agilent 2100 生物分析儀、RiboGreen 分析試劑和紫外光譜對總RNA進行定量比較），安捷倫應用簡報，出版號 5988-7650EN, 2002
2. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantita- tion , Electrophoresis, 21(1), 128-34,
2000
3. Advancing the quality control methodology to asses isolated total RNA and generated fragmented cRNA （通過改進質量控制方法評估游離總RNA 以及生成的 cRNA 片段，安捷倫應用簡報，出版號5988-9861EN, 2003
致謝
我們要特別感謝合作伙伴 Ambion
Inc.、德國基因組研究資源中心
(RZPD) 以及 Quantiom Bioinformatics。我們還要特別感謝對 RIN 算法進行內部測試并提供寶貴意見的所有研究人員。
