反相高效液相色譜已成為蛋白質(zhì)分析和表征的標(biāo)準(zhǔn)方法，尤其是治療性藥物的分析和表征。
反相色譜分析法分辨率高，檢測靈敏度好，能夠提供大量關(guān)于蛋白質(zhì)的信息。
有些時候，蛋白質(zhì)作為完整的分子分析，但更多的時候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，從而將蛋白質(zhì)裂解成小片段。
隨后用反相高效液相色譜法對裂解產(chǎn)生的肽段進(jìn)行分析。
該技術(shù)叫作肽圖分析，是一種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分析方法。
通過反相色譜分析蛋白質(zhì)裂解后的肽段能夠獲得蛋白質(zhì)的大量信息。
通過比較表達(dá)蛋白與參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的肽圖能夠得出蛋白純度和表達(dá)的準(zhǔn)確性。肽圖通常作為蛋白質(zhì)治療藥物的鑒定分析工具。

肽圖能夠確定糖基化（加入碳水化合物）位點，為詳細(xì)鑒定連接在其上的寡糖提供了條件。

能夠產(chǎn)生胰蛋白酶水解蛋白生成多肽的60~70%。Lys-C 的優(yōu)點是在高達(dá)4M的尿素濃度中仍能保持活性。

 胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個階段：（注：參考文獻(xiàn)21詳細(xì)回顧了胰蛋白酶的水解）

變性。要在合理的時間內(nèi)完成蛋白質(zhì)水解，必須對蛋白質(zhì)作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質(zhì)置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質(zhì)即可變性。

二硫鍵的還原。二硫鍵會阻止蛋白質(zhì)的完全變性。
通?？赏ㄟ^在待水解蛋白的變性過程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。

游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態(tài)，則有可能以錯誤的方式重新形成二硫鍵。
為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應(yīng)由100 mM DTT 退火。

脫鹽。當(dāng)溶液中存在尿素或胍鹽時，水解反應(yīng)無法進(jìn)行，因為胰蛋白酶自身作為一種蛋白質(zhì)會變性，失去酶活性。
尿素或胍鹽必須通過離子交換或滲析去除或?qū)舛冉档椭?M以下。

胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質(zhì)溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的最高活性pH）的緩沖液中 Tris或碳酸銨，并在20~100個待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區(qū)間內(nèi)處理蛋白質(zhì)。
低溫處理時間長達(dá)16個小時。在37℃下，水解可在1~4小時內(nèi)完成，具體取決于蛋白質(zhì)。
如果胰蛋白酶的時間、溫度或相對濃度均過低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發(fā)生，最終導(dǎo)致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。
如果胰蛋白酶的水解時間、溫度或濃度均過高，則會發(fā)生胰蛋白酶自身溶解，產(chǎn)生 自溶產(chǎn)物 ，即胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段，從而造成混淆。
慣常的做法是忽略蛋白質(zhì)，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質(zhì)完全水解的條件對得到的樣品進(jìn)行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產(chǎn)物的位置。
開發(fā)胰蛋白酶水解協(xié)議過程中，對胰蛋白酶和蛋白質(zhì)的水解時間、溫度和相對濃度進(jìn)行了優(yōu)化。
當(dāng)利用肽圖確定二硫鍵的位置時，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質(zhì)的水解速度非常慢。
在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過程中蛋白質(zhì)的變性。
水解過程中有時采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質(zhì)，但表面活性劑會降低色譜分辨率，應(yīng)盡量避免。

胰蛋白酶水解分析。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽段利用反相高效液相色譜分析，流動相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導(dǎo)致較早洗脫出肽的色譜的不可重現(xiàn)性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。
梯度洗脫的時間取決于待水解蛋白的大小。
大分子蛋白比小分子蛋白水解產(chǎn)生更多的肽段，因此肽段的分離需要更長洗脫時間。
小分子蛋白（小于20kd）水解產(chǎn)生的肽通?？稍?5~60分鐘內(nèi)完成分離。
大分子蛋白（20-50kd）需要較長的洗脫時間，一般為60~120分鐘。
分子量大于50kd的蛋白質(zhì)需要120~180分鐘的洗脫時間。
采用1~2 ml/min 的流速和適宜的溫度時分辨率最佳。
通常采用C18 反相柱?？梢允褂每讖綖?00埃或300埃的柱子，其選擇性通常不同。

圖31. 牛血清白蛋白的肽圖

色譜柱：ACE 5 C18-300 寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 體系，混合梯度洗脫120分鐘。
 

 
蛋白質(zhì)修飾引起肽保留時間的變化。如果蛋白質(zhì)因翻譯或表達(dá)錯誤，降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)）或過程變異而改變，則這種改變將會反映在一種或多種肽段。
由于與肽的反相相互作用的靈敏度，肽的任何變化都將導(dǎo)致該肽保留時間的變化。
在圖32示例中，相差一個氨基酸的兩種十肽，其中一個為蘇氨酸，另一個為絲氨酸，在反相HPLC圖譜中出現(xiàn)了兩個峰。
不僅僅是一個氨基酸的差別，而且兩種氨基酸均為羥基氨基酸，它們的不同之處在于蘇氨酸側(cè)鏈上加了一個甲基。
這說明了蛋白質(zhì)的任何變化都會反映為肽的變化，從而導(dǎo)致該肽保留時間的改變。
肽圖分析的本質(zhì)是反相HPLC能夠?qū)崿F(xiàn)差別細(xì)微的多肽的分離。

圖32. 以RP-HPLC對緊密關(guān)聯(lián)的肽類進(jìn)行分離。
僅有一個氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。

條件

色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脫液：

A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液

B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液

梯度：0 - 35%的B溶液超過73分鐘

試樣肽圖與參照蛋白質(zhì)肽圖的比較。肽圖能夠提供有關(guān)蛋白質(zhì)的很多信息。
慣常做法是對試樣的肽圖和參照蛋白質(zhì)的肽圖進(jìn)行比較。
圖33對重組人生長激素（在大腸桿菌中表達(dá)）的肽圖和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）的肽圖進(jìn)行了比較。
由于甲硫氨酸的疏水性質(zhì)，重組人生長激素比天然人生長激素較晚洗脫出來。
在這個例子中，為了便于比較，將第二幅圖譜倒置顯示。
在一些情況下，為了確認(rèn)微小的變化和證明分析工具與肽圖的變化無關(guān)，會將兩種水解產(chǎn)物混合進(jìn)行色譜分析。

肽圖比較揭示了蛋白質(zhì)的改變和修飾，如：基因改變、翻譯錯誤、蛋白降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)），以及翻譯后修飾的改變。

圖33. 重組人生長激素和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）肽圖的比較。

條件：

色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動相：0~70% 乙腈-0.1% TFA 體系梯度洗脫