在梯度洗脫期間，當(dāng)有機(jī)溶劑量達(dá)到針對每一蛋白質(zhì)的特定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)就會從疏水界面上解吸，繼續(xù)順著柱向下，從而從柱中洗脫。
圖14. 當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值時(shí)，蛋白質(zhì)從疏水界面洗脫。

乙腈。在多肽的反相色譜分離時(shí)最常用的有機(jī)溶劑為乙腈。為什么選擇乙腈？

異丙醇。異丙醇在多肽的色譜分離中具有重要作用。盡管異丙醇黏度大（會增大柱壓），很少單獨(dú)用作有機(jī)改性劑，但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用，尤其是強(qiáng)疏水性蛋白。
在此類情況下，以1%~5%的恒定濃度加入異丙醇，以提高疏水性多肽的回收率或洗脫。
 

其它有機(jī)改性劑。很少使用甲醇或乙醇等有機(jī)改性劑，除非在分離強(qiáng)疏水性蛋白時(shí)。此外，由于乙醇毒性低，因此還用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化。

梯度洗脫。多肽的洗脫幾乎都采用梯度洗脫法，采用梯度洗脫法分離時(shí)，逐漸增大有機(jī)溶劑的相對濃度。
當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度升到解吸所需的特定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)和多肽就從柱上洗脫。如圖15所示，有機(jī)改性劑的濃度（梯度）變化速率越慢，這些蛋白亞基的分辨率越高。
在該例中，相較于每分鐘0.5%的梯度變化速率，每分鐘0.25%的梯度變化顯著提高了分辨率。
蛋白質(zhì)/多肽的保留機(jī)制的圖1中顯示了采用每分鐘0.15%的梯度變化速率時(shí)幾種胰島素的分離過程。采用每分鐘0.05%的梯度變化速率洗脫時(shí)，分辨率最大。
 

圖15. 一般情況下，降低有機(jī)溶劑濃度變化速率會提高分辨率。

A.  細(xì)胞色素c亞基

B.  色譜圖A中間片段的重現(xiàn)。

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

降低梯度變化速率增加分辨率時(shí)，所需的分析時(shí)間必須盡可能短。
但是，梯度變化速率的調(diào)整在優(yōu)化蛋白質(zhì)和多肽的分辨率方面非常重要。
 

有時(shí)，降低梯度變化速率時(shí)，多肽會表現(xiàn)出特異行為（圖16）。
分辨率有時(shí)不會按照預(yù)期增加，反而會降低，導(dǎo)致出現(xiàn)共洗脫，甚至洗脫順序也會顛倒。
在圖16的示例中，洗脫時(shí)間為45分鐘時(shí)多肽11和12表現(xiàn)出最佳的分離效果。
當(dāng)洗脫時(shí)間增加至90分鐘時(shí)，多肽11和12間的分辨率降低；而當(dāng)洗脫時(shí)間增加至160分鐘時(shí)，出現(xiàn)共洗脫峰。
這種保留行為是多肽表面相互作用的結(jié)果，導(dǎo)致這種行為的原因目前尚不清楚。
因此，在進(jìn)行多肽分離時(shí)，尤其是在分離蛋白酶水解物時(shí)，觀察分辨率隨梯度坡度降低的變化很重要。
如果分辨率未增加，反而降低，則必須優(yōu)化梯度變化速率，以最大化整體分辨率。
 

圖16. 多肽間分辨率有時(shí)隨著溶劑濃度變化速率的降低（洗脫時(shí)間增加）而降低。
這將導(dǎo)致分辨率降低或共洗脫峰的出現(xiàn)，如人生長激素肽圖中多肽11和12例示。
在一些情況下，多肽甚至?xí)孓D(zhuǎn)洗脫順序。

樣品人生長激素的胰蛋白酶水解物。部分顯示了多肽圖譜。

色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 150 mm

洗脫液：梯度：0~60%乙腈與水溶性溶劑和0.1%TFA混合液和有機(jī)溶劑與0.08%TFA混合液在一定時(shí)間內(nèi)形成梯度洗脫。

蛋白質(zhì)和多肽的反相色譜分析法需要 離子對試劑 。
在流動(dòng)相中加入離子對試劑，以實(shí)現(xiàn)良好的峰形。
目前認(rèn)為，在沒有離子對試劑的情況下，硅膠表面的金屬雜質(zhì)是導(dǎo)致蛋白質(zhì)/多肽峰形較差的原因。

三氟乙酸。三氟乙酸（TFA）是最常用的離子對試劑。將濃度為~0.1%的三氟乙酸加入流動(dòng)相，會在大多數(shù)柱上產(chǎn)生良好的峰形（圖17）。
降低TFA的濃度能提高LC-MS的檢測靈敏度（見22~25頁），但由于硅膠表面存在雜質(zhì)，可能會導(dǎo)致硅膠柱上的峰形較差。
但采用高純度硅膠柱時(shí)，可加入低濃度TFA（圖17A 0.01% TFA）。

圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時(shí)間為15分鐘。
樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I

其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質(zhì)/多肽分離有時(shí)會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑。

如圖18所示，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM，pH為2~2.5。此外，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質(zhì)的分離效果要優(yōu)于TFA。
盡管同TFA一樣，磷酸鹽緩沖液使用的pH通常較低，但磷酸鹽緩沖液也能適應(yīng)較高的pH，為選擇性和分辨率的改變提供了機(jī)會（見17頁）。
將磷酸鹽作為離子對試劑的主要弊端是：磷酸鹽不揮發(fā)，很難從肽中去除。

一些時(shí)候，七氟丁酸用作組蛋白等堿性蛋白分離的離子對試劑

圖18. 使用除TFA以外的離子對試劑可能會產(chǎn)生不同的選擇性

條件
色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脫液：
A.4%~40% 乙腈 0.1%TFA體系，pH=2,18分鐘梯度洗脫。
B.4%~40% 乙腈 20mM 磷酸體系，pH=2,18分鐘梯度洗脫。
樣品:

pH值對多肽保留行為的影響。不論采用TFA和磷酸，還是其它離子對試劑，用于多肽分離的反相流動(dòng)相通常適應(yīng)的pH值較低。
在低pH值條件下，羧酸基團(tuán) 端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈會進(jìn)行質(zhì)子化，且僅有輕微極性。
將流動(dòng)相的pH值增加至6~7將會使羧酸基團(tuán)離子化，減弱多肽的疏水性。這將降低各種多肽的保留值，但尤其影響含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（圖19）。
與其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，從而改變了選擇性。盡管增加多肽分離流動(dòng)相pH的做法不經(jīng)常采用，但它可以在一些特定情況下發(fā)揮作用。

圖19. 流動(dòng)相的pH值會影響多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。

條件
色譜柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脫液：
A.20%~32% 乙腈 0.1%TFA體系，pH=2,15分鐘梯度洗脫。
B.20%~32% 乙腈 10mM NH4OAc體系，pH=7,15分鐘梯度洗脫。
樣品

流速。流動(dòng)相的流速對反相高效液相色譜法分離的分辨率影響不大。
如圖20所示，流動(dòng)相流速為0.5、1.0或2.0 ml/min時(shí)，胰蛋白酶圖譜中多肽的分辨率大致相同。
但梯度體積必須恒定才能維持分辨率一致。
這需要隨著流速的增加減少梯度洗脫時(shí)間。
體系壓力隨著流速的增加而增加；體系壓力可能會限制可用的流速。
此外，較高的流速還會使檢測靈敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。

圖20. 流動(dòng)相的流速對多肽的分辨率影響不大。隨著流速的變化，總梯度體積必須保持恒定才能維持分辨率一致。

條件
色譜柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脫液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 體系，時(shí)間、流速如圖所示
樣品 -乳球蛋白的胰蛋白酶水解物