手機(jī)版|
二維碼|
NACIA數(shù)字PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同：普通PCR的目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格；而數(shù)字PCR引物跟real-time PCR引物一樣對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。
NACIA數(shù)字PCR引物及探針設(shè)計(jì)的總體原則
v 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
v 所選列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段。
v 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在50-150bp內(nèi)。
v 保持GC含量在30%~80%之間。
v 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）。
v 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。
v 一些需額外考慮的因素：
☆ 引物的3 端避免使用堿基A，引物的3 端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基 。
☆ 如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
☆ 盡量避免Dimer（二聚體）配對(duì)區(qū)域在3 末端。
☆ 盡量避免3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基錯(cuò)配形成False priming（錯(cuò)配）
☆ 衡量二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)
盡量保證自由能的絕對(duì)值 10（可選）
為了避免基因表達(dá)過程中檢測(cè)到DNA，設(shè)計(jì)應(yīng)盡量跨內(nèi)含子區(qū)，這可確保擴(kuò)增的產(chǎn)品只能使用mRNA作為模板。
數(shù)字PCR 數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR引物設(shè)計(jì)基本原則
☆ 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：50-150個(gè)堿基
☆ 引物長(zhǎng)度：18-24個(gè)堿基（20個(gè)堿基最優(yōu)）
☆ Tm值：58℃到 60℃，引物之間的TM相差避免超過2℃
☆ GC含量：30%到80%
☆ 3 端的最后5個(gè)堿基內(nèi)不應(yīng)有超過2個(gè)G+C
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G
☆ 探針位置盡可能地靠近上游引物，但不能重疊
NACIA數(shù)字PCR探針設(shè)計(jì)基本原則
☆ 探針長(zhǎng)度：13-25個(gè)堿基（MGB探針）；13-30個(gè)堿基（普通Taqman探針）
☆ Tm值：68 C 到 70 C(PrimerExpress 計(jì)算結(jié)果)；通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）
☆ GC含量：30%到80%
☆ 5 端第一個(gè)堿基不能為G
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G ；避免6個(gè)連續(xù)的A出現(xiàn)
☆ 對(duì)于MGB探針，盡量避免在探針的中部出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上連續(xù)的C,3 端的堿基應(yīng)避免為 GGG 或 GGAG
☆ 對(duì)于FAM 標(biāo)記的探針，5 端的第二個(gè)堿基不能為G
☆ 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量
NACIA數(shù)字PCR探針熒光標(biāo)記物選擇: NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR多重探針設(shè)計(jì)原則
☆ 所有靶基因的引物或探針的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建議在55-60℃，探針的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，比如FAM、HEX或CY5，并且要選擇發(fā)射波長(zhǎng)之間滲透最小的熒光報(bào)告基團(tuán)，
☆ 同時(shí)要與數(shù)字PCR 系統(tǒng)的熒光檢測(cè)通道參數(shù)兼容。 NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR推薦引物探針設(shè)計(jì)軟件:Beacon designer, Primer 3 ,Primer express等。 聯(lián)系我們： 北京深藍(lán)云生物科技有限公司 地址：北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)經(jīng)海四路25號(hào)院2號(hào)樓2單元2層201室 電話：010-57256059 郵箱：info@cycloudbio.com 官網(wǎng)：www.cycloudbio.com
NACIA數(shù)字PCR引物及探針設(shè)計(jì)的總體原則
v 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
v 所選列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段。
v 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在50-150bp內(nèi)。
v 保持GC含量在30%~80%之間。
v 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）。
v 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。
v 一些需額外考慮的因素：
☆ 引物的3 端避免使用堿基A，引物的3 端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基 。
☆ 如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
☆ 盡量避免Dimer（二聚體）配對(duì)區(qū)域在3 末端。
☆ 盡量避免3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基錯(cuò)配形成False priming（錯(cuò)配）
☆ 衡量二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)
盡量保證自由能的絕對(duì)值 10（可選）
為了避免基因表達(dá)過程中檢測(cè)到DNA，設(shè)計(jì)應(yīng)盡量跨內(nèi)含子區(qū)，這可確保擴(kuò)增的產(chǎn)品只能使用mRNA作為模板。
數(shù)字PCR 數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR引物設(shè)計(jì)基本原則
☆ 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：50-150個(gè)堿基
☆ 引物長(zhǎng)度：18-24個(gè)堿基（20個(gè)堿基最優(yōu)）
☆ Tm值：58℃到 60℃，引物之間的TM相差避免超過2℃
☆ GC含量：30%到80%
☆ 3 端的最后5個(gè)堿基內(nèi)不應(yīng)有超過2個(gè)G+C
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G
☆ 探針位置盡可能地靠近上游引物，但不能重疊
NACIA數(shù)字PCR探針設(shè)計(jì)基本原則
☆ 探針長(zhǎng)度：13-25個(gè)堿基（MGB探針）；13-30個(gè)堿基（普通Taqman探針）
☆ Tm值：68 C 到 70 C(PrimerExpress 計(jì)算結(jié)果)；通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）
☆ GC含量：30%到80%
☆ 5 端第一個(gè)堿基不能為G
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G ；避免6個(gè)連續(xù)的A出現(xiàn)
☆ 對(duì)于MGB探針，盡量避免在探針的中部出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上連續(xù)的C,3 端的堿基應(yīng)避免為 GGG 或 GGAG
☆ 對(duì)于FAM 標(biāo)記的探針，5 端的第二個(gè)堿基不能為G
☆ 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量
NACIA數(shù)字PCR探針熒光標(biāo)記物選擇: NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR多重探針設(shè)計(jì)原則
☆ 所有靶基因的引物或探針的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建議在55-60℃，探針的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，比如FAM、HEX或CY5，并且要選擇發(fā)射波長(zhǎng)之間滲透最小的熒光報(bào)告基團(tuán)，
☆ 同時(shí)要與數(shù)字PCR 系統(tǒng)的熒光檢測(cè)通道參數(shù)兼容。 NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR推薦引物探針設(shè)計(jì)軟件:Beacon designer, Primer 3 ,Primer express等。 聯(lián)系我們： 北京深藍(lán)云生物科技有限公司 地址：北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)經(jīng)海四路25號(hào)院2號(hào)樓2單元2層201室 電話：010-57256059 郵箱：info@cycloudbio.com 官網(wǎng)：www.cycloudbio.com
