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NACIA數(shù)字PCR引物探針設(shè)計(jì)——Gene

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-06-13  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):437
NACIA數(shù)字PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同:普通PCR的目的是獲得目的基因,對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格;而數(shù)字PCR引物跟real-time PCR引物一樣對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。
NACIA數(shù)字PCR引物及探針設(shè)計(jì)的總體原則
v 先選擇好探針,然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
v 所選列應(yīng)該高度特異,盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段。
v 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過400bp,理想的最好能在50-150bp內(nèi)。
v 保持GC含量在30%~80%之間。
v 為了保證效率和重復(fù)性,應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列,尤其是G(不能有4個(gè)連續(xù)的G)。
v 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè),以避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。
v 一些需額外考慮的因素:
☆ 引物的3 端避免使用堿基A,引物的3 端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基 。
☆ 如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu),那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
☆ 盡量避免Dimer(二聚體)配對(duì)區(qū)域在3 末端。
☆ 盡量避免3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基錯(cuò)配形成False priming(錯(cuò)配)
☆ 衡量二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng),如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)
盡量保證自由能的絕對(duì)值 10(可選)
為了避免基因表達(dá)過程中檢測(cè)到DNA,設(shè)計(jì)應(yīng)盡量跨內(nèi)含子區(qū),這可確保擴(kuò)增的產(chǎn)品只能使用mRNA作為模板。
數(shù)字PCR   數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR引物設(shè)計(jì)基本原則
☆ 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度:50-150個(gè)堿基
☆ 引物長(zhǎng)度:18-24個(gè)堿基(20個(gè)堿基最優(yōu))
☆ Tm值:58℃到 60℃,引物之間的TM相差避免超過2℃
☆ GC含量:30%到80%
☆ 3 端的最后5個(gè)堿基內(nèi)不應(yīng)有超過2個(gè)G+C
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列,尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G
☆ 探針位置盡可能地靠近上游引物,但不能重疊
NACIA數(shù)字PCR探針設(shè)計(jì)基本原則
☆ 探針長(zhǎng)度:13-25個(gè)堿基(MGB探針);13-30個(gè)堿基(普通Taqman探針)
☆ Tm值:68 C 到 70 C(PrimerExpress 計(jì)算結(jié)果);通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)
☆ GC含量:30%到80%
☆ 5 端第一個(gè)堿基不能為G
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列,尤其是不能有4個(gè)連續(xù)的G ;避免6個(gè)連續(xù)的A出現(xiàn)
☆ 對(duì)于MGB探針,盡量避免在探針的中部出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上連續(xù)的C,3 端的堿基應(yīng)避免為 GGG 或 GGAG
☆ 對(duì)于FAM 標(biāo)記的探針,5 端的第二個(gè)堿基不能為G
☆ 整條探針中,堿基C的含量要明顯高于G的含量
NACIA數(shù)字PCR探針熒光標(biāo)記物選擇: NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR多重探針設(shè)計(jì)原則
☆ 所有靶基因的引物或探針的Tm 值要相接近,引物的Tm 值建議在55-60℃,探針的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán),比如FAM、HEX或CY5,并且要選擇發(fā)射波長(zhǎng)之間滲透最小的熒光報(bào)告基團(tuán),
☆ 同時(shí)要與數(shù)字PCR 系統(tǒng)的熒光檢測(cè)通道參數(shù)兼容。 NACIA數(shù)字PCR NACIA數(shù)字PCR推薦引物探針設(shè)計(jì)軟件:Beacon designer, Primer 3 ,Primer express等。 聯(lián)系我們: 北京深藍(lán)云生物科技有限公司 地址:北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)經(jīng)海四路25號(hào)院2號(hào)樓2單元2層201室 電話:010-57256059 郵箱:info@cycloudbio.com 官網(wǎng):www.cycloudbio.com
 
 
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