在直接檢測(cè)方法中，酶直接連接到一抗上(圖1.5)。操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)步驟少。雖然直接檢測(cè)是快速和直接的，但它往往比間接檢測(cè)的靈敏度低，因?yàn)樵谶@個(gè)過(guò)程中可以發(fā)生信號(hào)放大的步驟更少。此外，酶直接標(biāo)記到一抗上可能會(huì)造成成本和資源上的限制。
 
間接western blot檢測(cè)方法
間接檢測(cè)方法比直接檢測(cè)方法更受歡迎，主要是靈敏度更高。通過(guò)間接檢測(cè)，識(shí)別感興趣的抗原的抗體，稱為一抗，(圖1.5)。檢測(cè)是通過(guò)添加標(biāo)記的二抗實(shí)現(xiàn)的，二抗可以識(shí)別一抗上的特定表位。這種表位通常是種屬特異性的；例如，在兔體內(nèi)產(chǎn)生的幾種不同的一抗都可以被同一種抗兔二抗體所識(shí)別。 當(dāng)多個(gè)二抗與單一一抗結(jié)合，這使得檢測(cè)靈敏度提高，還增加了檢測(cè)的靈活性，因?yàn)橛糜跈z測(cè)二抗的標(biāo)簽的類型可以輕松更改。
 
抗體質(zhì)量和種類
影響Western blot結(jié)果的主要因素之一是抗體的質(zhì)量，尤其是一抗的質(zhì)量。高質(zhì)量的抗體-具有高特異性、高結(jié)合親和力和低背景-增加了檢測(cè)的特異性和敏感性，單克隆和多克隆一抗均可用。
一抗
多克隆抗體-多克隆抗體是利用機(jī)體對(duì)感興趣的抗原的免疫反應(yīng)獲得的。它們直接從免疫動(dòng)物的血清中分離出來(lái)，通常是兔子、山羊、驢或綿羊，因此是動(dòng)物產(chǎn)生的所有抗體的復(fù)雜混合物。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，單個(gè)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，這種抗體可以識(shí)別抗原上的特定表位，不同的B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以識(shí)別不同的表位。由于多克隆抗體識(shí)別抗原上的不同位點(diǎn)，多個(gè)抗體可以同時(shí)與抗原結(jié)合，使得多克隆抗體比單克隆抗體更敏感。然而，這種廣泛的結(jié)合特異性有時(shí)會(huì)導(dǎo)致多克隆抗體具有更高的背景信號(hào)。
 
單克隆抗體-單克隆抗體是從雜交瘤細(xì)胞系的上清液中收集而來(lái)的，雜交瘤細(xì)胞系是將單個(gè)抗體合成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系通常來(lái)源于小鼠或大鼠。由于使用的是單一的抗體產(chǎn)生細(xì)胞或克隆，雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體相同，都能識(shí)別抗原上相同的表位。單克隆抗體比多克隆抗體信號(hào)弱，因?yàn)閱慰寺】贵w只與單個(gè)蛋白結(jié)合
 
二抗
有多種類型的二抗可用于Western blotting檢測(cè)，使用的二抗類型取決于一抗的種類和類別、檢測(cè)方法等考慮因素
一抗的種類 單克隆一抗的種類和類型通常來(lái)源于小鼠或大鼠細(xì)胞，而多克隆抗體可從多種動(dòng)物中分離得到。二抗必須對(duì)一抗物種具有識(shí)別特異性。因此，抗小鼠或大鼠的二抗必須與單克隆抗體同時(shí)使用，而從兔體內(nèi)分離出一抗時(shí)，則應(yīng)使用抗兔二抗。根據(jù)組成抗體的重鏈分子和輕鏈分子的類型，抗體可以分為不同的類和亞型(也稱為同型)。二抗必須與一抗類別或亞型相匹配，以便進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖R(shí)別?？梢再?gòu)買能夠識(shí)別所有類別(即所有小鼠IgG抗體)或特定類別(如小鼠IgG2a)的二抗。具有特定亞型的二抗對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白也很有用，因?yàn)槊總€(gè)二抗可以有不同的標(biāo)簽。
特異性二抗
Anti H+L 抗重鏈和輕鏈抗體(H+L)對(duì)目標(biāo)蛋白的重鏈和輕鏈部分都具有特異性。當(dāng)一抗的種類未知時(shí)，通常使用這種類型的二抗。
輕鏈特異性-當(dāng)免疫沉淀后進(jìn)行Western blotting，通常使用只識(shí)別抗體輕鏈部分的抗體。使用該抗體可防止識(shí)別沉淀抗體的重鏈
 
抗體純化
一抗和二抗均可純化減少背景信號(hào)
親和純化 親和純化使用親和柱來(lái)去除不與所需表位結(jié)合的抗體。親和純化抗體具有更高的特異性，因?yàn)榇嬖谳^少的目標(biāo)外結(jié)合抗體。
預(yù)吸附-預(yù)吸附抗體也可以用來(lái)提高結(jié)合的特異性和減少交叉反應(yīng)。例如，兔抗IgG抗體可能被預(yù)先吸附在小鼠、大鼠和山羊的IgG上，以防止識(shí)別其他種類的IgG。預(yù)吸附抗體具有很高的特異性，推薦用于多重Western blotting。
 
抗體標(biāo)記
 
在選擇一抗(直接檢測(cè))或二抗(間接檢測(cè))抗體時(shí)，一個(gè)重要的考慮因素是與抗體結(jié)合的標(biāo)簽類型。酶標(biāo)記(用于化學(xué)發(fā)光或膠片檢測(cè))、熒光標(biāo)記或其他用于放大信號(hào)的小分子(生物素)。
 
酶標(biāo)記-最常用的兩種酶是堿性磷酸酶(AP)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。許多抗體都可以使用酶標(biāo)記，這使得此類抗體非常受歡迎。由于是酶促反應(yīng)，必須控制曝光來(lái)采集信號(hào)?；瘜W(xué)發(fā)光具有過(guò)飽和限制，限制了檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。 熒光標(biāo)記 檢測(cè)抗體也可以直接用熒光基團(tuán)標(biāo)記，使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。在適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)下，熒光基團(tuán)發(fā)出稍長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。然后發(fā)射的光被成像儀捕獲并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。與依賴酶的檢測(cè)方法不同，熒光基團(tuán)發(fā)出的光是一致的，并且與膜上的蛋白量成正比，從而達(dá)到精準(zhǔn)定量。 其它標(biāo)記物-生物素標(biāo)記的抗體可用于對(duì)低豐度蛋白的靈敏檢測(cè)。該系統(tǒng)依賴于生物素與熒光標(biāo)記(或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)親和素/鏈霉親和素之間的強(qiáng)結(jié)合作用。檢測(cè)抗體通常與多個(gè)生物素分子結(jié)合，當(dāng)多個(gè)標(biāo)記的親和素/鏈霉親和素分子與生物素分子結(jié)合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。