干旱脅迫對于植物來說，是一個(gè)全球普遍存在的問題。會限制植物的生長發(fā)育。西北是我國蘋果的最大產(chǎn)區(qū)，長期的中度干旱是限制蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素，然而目前果樹方面關(guān)于中度干旱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制研究較少。

樣本來源

蘋果砧木葉片組織，4組樣本分別來源于干旱敏感型材料M26（干旱處理、對照）、干旱耐受型材料MBB（干旱處理、對照）。

技術(shù)路線

iTRAQ，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)

研究結(jié)果

1. 中度干旱脅迫響應(yīng)的生理變化

研究團(tuán)隊(duì)測定了4組樣本的相對含水量（RWC）、葉面積（LA）、比葉重(LMA)、游離脯氨酸含量(CFP)、可溶性糖含量(CSS)、丙二醛含量 (MDA)。生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RWC, CFP, CSS以及MDA的變化可能會影響蘋果砧木對于中度干旱耐受程度。與M26相比，MBB在中度干旱脅迫下能夠產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2. 磷酸化修飾位點(diǎn)以及磷酸化蛋白鑒定
本次共鑒定到595個(gè)磷酸化肽段，682個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)以及446個(gè)磷酸化蛋白。這682個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)分別位于絲氨酸（86.95%）、蘇氨酸（11.73%）以及酪氨酸（1.32%）。

磷酸化修飾位點(diǎn)分布

3. 差異磷酸化蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析
通過分別與對照比較，中度干旱脅迫下的M26和MBB中，磷酸化水平顯著變化的蛋白分別為5個(gè)和35個(gè)。其中4個(gè)在兩個(gè)材料中都有，這有可能是兩個(gè)基因型在響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制方面有一些相似之處。在本次鑒定446個(gè)的蛋白中，有26個(gè)為蛋白激酶，其中10個(gè)為常見的干旱脅迫響應(yīng)激酶，但在本次研究中，這些激酶幾乎都沒有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異。

在獲得差異磷酸化修飾肽段及蛋白信息后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了GO分析。結(jié)果表明這些差異磷酸化蛋白與代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白加工等有關(guān)。

差異蛋白質(zhì)的Venn圖

差異磷酸化蛋白質(zhì)的GO功能分析

隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用motif-X對于差異蛋白的磷酸化修飾進(jìn)行特征分析，結(jié)果表明，在差異磷酸化蛋白中，磷酸化修飾均位于絲氨酸，且[PxsP], [sP], [sD], [Rxxs], [sxP] 和 [sxs]等6種修飾特征最為普遍。

差異磷酸化蛋白質(zhì)的修飾特征分析

4.  qRT-PCR 驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)選擇了17個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。結(jié)果表明，M26中ACBP4基因表達(dá)水平下降，此時(shí)蛋白磷酸化修飾水平上升。在MBB中，RPL5, eIF3B, Hsp70, Hsp70-90, DEK 以及 TUBA3在表達(dá)水平顯著增加，與磷酸化水平變化趨勢一致。這些結(jié)果表明，在中度干旱脅迫下，蘋果砧木的mRNA與蛋白磷酸化修飾的變化有一定的相關(guān)性。

qRT-PCR 驗(yàn)證

小編心得

本文利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（iTRAQ）對比了干旱敏感基因型材料M26以及干旱耐受型MBB在中度干旱脅迫條件下的生理學(xué)和磷酸化蛋白組方面的變化。通過目前常見的生信分析（GO、Motif-X）以及驗(yàn)證手段（qPCR）獲取可信度較高的目標(biāo)性磷酸化修飾蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步的安濤蘋果中度干旱耐受的分子機(jī)制，提供更為準(zhǔn)確的研究范圍。