永久性的染色過程被稱為熒光標(biāo)定。熒光標(biāo)定過程是一個(gè)化學(xué)過程
，通過化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)熒光團(tuán)與非熒光分子如蛋白質(zhì)、核酸或是合成聚合物
之間的吸附。標(biāo)定過程通常會(huì)采用一種熒光團(tuán)反應(yīng)衍生物，這種物質(zhì)可
以與目標(biāo)分子的功能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。換句話說，通過這個(gè)過程便可以產(chǎn)生
熒光分子。

為了實(shí)現(xiàn)樣品在顯微鏡下發(fā)出熒光，不論是采用熒光染色還是熒光
標(biāo)定的方法，染色以及標(biāo)定過程本身不能改變樣品或分子本身特有的性
質(zhì)。

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡(fluorescence microscopy，F(xiàn)M)是利用熒光現(xiàn)象而不
是光學(xué)反射或光學(xué)吸收的一種光學(xué)設(shè)備或光學(xué)顯微鏡。一般來說，在單
色紫外光燈照射下，樣品被檢測(cè)的區(qū)域部分必須能夠發(fā)出熒光。

  傳統(tǒng)的熒光顯微鏡示意圖。其核心組成部分是水銀弧光燈或氙弧光
燈光源，感光濾光片(或是一組濾光鏡)允許指定的單色紫外光線通過，
分色鏡(分光鏡)使得激發(fā)光(短波長(zhǎng))被鏡子反射但發(fā)射光(長(zhǎng)波長(zhǎng))可以
通過，樣品臺(tái)、發(fā)光濾波片(或是一組濾光鏡)使得熒光通過并到達(dá)探測(cè)
器，兩組透鏡(即聚光鏡(激發(fā)光)和物鏡(發(fā)射光))探測(cè)器用來探測(cè)圖像
。除此之外還要選擇與激發(fā)光光譜相匹配的分色鏡及與發(fā)光光譜相匹配
的熒光團(tuán)來標(biāo)定樣品。

如果樣品的某個(gè)需要被檢測(cè)的區(qū)域不能吸收紫外光繼而發(fā)射熒光，
該區(qū)域就必須采用熒光染料或是化學(xué)標(biāo)定進(jìn)行染色。

在光照條件下，熒光團(tuán)會(huì)漸漸失去發(fā)出熒光的特性，這個(gè)過程被稱
為光漂白。多數(shù)的光漂白可以歸因于自由基，特別是強(qiáng)光照更會(huì)加速光
漂白的過程。其結(jié)果就是在短短時(shí)間內(nèi)熒光團(tuán)被“殺死”。因此必須采
取一些特殊的措施來抑制光漂白。比如采用較為“強(qiáng)烈”的熒光團(tuán)或是
減小光照的能量和縮短光照的時(shí)間。

傳統(tǒng)的熒光顯微鏡可以非常方便地觀察熒光樣品的表面形貌，

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