高解析低溫免疫電子顯微鏡技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用

用免疫過氧化物酶方法定位培養(yǎng)細(xì)胞和組織的抗原

  在EM水平上運用免疫過氧化物酶標(biāo)記與其他方法相比較有其自
身的優(yōu)點：①敏感性高；②通過PLP的固定將細(xì)胞器及其結(jié)構(gòu)在形
態(tài)保存上可達(dá)到傳統(tǒng)的戊二醛固定樣本的要求；③方法簡單，除了
那些需要特殊包埋的樣本外，不要求特別的技術(shù)與儀器。然而，免
疫過氧化物酶標(biāo)記與免疫金標(biāo)記方法相比有三個重要的缺陷：①免
疫過氧化物酶標(biāo)記從本身來說不能定量；②免疫過氧化物酶不能避
免潛在的DAB反應(yīng)產(chǎn)物的擴散而遠(yuǎn)離抗原抗體反應(yīng)部位；③一般來
說，靠過氧化物酶進(jìn)行免疫雙標(biāo)記是不可能的。盡管過氧化物酶有
其缺陷，但此方法對細(xì)胞膜連接細(xì)胞器的分子定位非常有用。
  在組織細(xì)胞內(nèi)定位抗原可以提供一類有價值的數(shù)據(jù)，這類數(shù)據(jù)
可以作為用過氧化物酶標(biāo)記技術(shù)在培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得的即定數(shù)據(jù)的
補充(見基本方案1)。因為運用這種方法通常能檢測出大量不同類
型的細(xì)胞，所以該方法要求實驗人員能熟練操作低溫組織切片機。

  運用高解析的低溫免疫金電子顯微鏡技術(shù)定位亞細(xì)胞蛋白質(zhì)／
抗原，此方法可在超微水平上進(jìn)行局部解剖生化的研究。
  運用這種方法最常遇到的染色困難是低質(zhì)量的切片，缺乏特異
性標(biāo)記，背景著色深，假陽性，對比弱。差的切片通常由于標(biāo)本制
備不當(dāng)或冰凍切片機不穩(wěn)定。非特異性標(biāo)記是由于在乙醛固定之后
抗體不能識別抗原；特異性標(biāo)記最理想的對照是在一類不表達(dá)目標(biāo)
抗原的細(xì)胞中過表達(dá)該抗原。假陽性常常在運用雙標(biāo)記時出現(xiàn)。在
這種情況下，金顆粒的兩側(cè)粘連在一起，之間距離小于20nm，這樣
常常被誤認(rèn)為是只定位。柵格上的污點常常由試劑的磷酸化污染引
起。另外，在免疫孵育過程中切片干燥也會產(chǎn)生污點。

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