細(xì)胞的裂解方法-細(xì)胞壁觀察圖像分析顯微鏡

  對(duì)于獲得準(zhǔn)確、有意義的分析數(shù)據(jù)而言，分離核酸的質(zhì)量是至
關(guān)重要的為了從復(fù)雜的基質(zhì)如細(xì)胞裂解液中獲得高純度的核酸，要
精心設(shè)計(jì)樣品前處理過(guò)程。去除的典型雜質(zhì)包括細(xì)胞碎片、小分子
、蛋白、細(xì)胞液、糖類、失活的細(xì)胞核酸酶和不需要的核酸。早年
人們?cè)?jīng)嘗試將離心后的裂解液直接注射入色譜，但很快發(fā)現(xiàn)這樣
會(huì)降低色譜柱的性能，造成背景干擾，增大柱后壓等。此外，背景
中蛋白等物質(zhì)不可逆的吸附，會(huì)改變色譜的選擇性

  細(xì)胞裂解方法

  提取核酸的第一步是細(xì)胞裂解和核酸酶的滅活，二者可以同時(shí)
進(jìn)行；例如，單一的提取液可以包括溶解細(xì)胞膜所用的表面活性劑
和滅活胞內(nèi)酶所需的強(qiáng)離液鹽：
  裂解的過(guò)程取決于細(xì)胞壁的性質(zhì)，因此在研究中需要了解細(xì)胞
壁的組成和結(jié)構(gòu)信息。例如，真菌主要有兩種細(xì)胞壁，能夠通過(guò)與
特定染料的反應(yīng)而得到辨認(rèn)，這種染料是Christian Gμm于19世紀(jì)
80年代發(fā)現(xiàn)的，被稱為革蘭氏染料，是一種結(jié)晶紫染料與碘的混合
物。當(dāng)加入革蘭氏染料時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞被染成紫色，而革蘭氏
陰性細(xì)胞則變?yōu)榧t色。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚(30～100nm)，
而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較簿(20～30nm)。約40％～80％的革蘭氏
陽(yáng)性菌細(xì)胞壁是由·種堅(jiān)硬而復(fù)雜的聚合物(肽聚糖)組成，見(jiàn)圖8
．2，是由短肽所連接的線性雜多糖，具有很高的交聯(lián)度。岡此，
革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁(如化膿性鏈球菌)對(duì)于能水解肽鏈的青霉素
及其衍生物和溶菌酶(一種在IliON和唾液中發(fā)現(xiàn)的酶)十分敏感。
而革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的細(xì)胞壁有一種顯著的層狀外觀，如
圖8．3所示，其內(nèi)部由單層肽聚糖組成，外部則基本為含蛋白的脂
雙層在革蘭氏陰性菌中，15％～20％的細(xì)胞壁由斷續(xù)交聯(lián)的肽聚糖
組成，交聯(lián)度決定了細(xì)胞壁的韌性。一般而言，革蘭氏陽(yáng)性菌比革
蘭氏陰性菌更難裂解，新細(xì)胞比老細(xì)胞更難裂解，而小細(xì)胞比大細(xì)
胞更難以列解

細(xì)胞的裂解有多種方法，但是沒(méi)有哪一種方法能用于所有的生物源
細(xì)胞。每一一種技術(shù)都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，裂解方法的選擇取決于細(xì)
胞的特點(diǎn)、種類以及后續(xù)的心用。在細(xì)胞裂解中，也可以同時(shí)使川
多種方法，如酶裂解法使用特定的酶作用于細(xì)胞壁，而可以破壞由
脂雙層構(gòu)成的細(xì)胞質(zhì)膜，需要同時(shí)使用能夠溶解脂質(zhì)的表面活性劑
，選擇一種裂解方法時(shí)，應(yīng)既能有足夠的破壞性達(dá)到裂解細(xì)胞的目
的，則致破壞目標(biāo)核酸的完整性。當(dāng)提取超聲破碎法
  細(xì)胞超聲破碎法是利用超聲探針針尖的快速振動(dòng)所產(chǎn)生的超聲
波，即空化作用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎的方法?？栈瘯?huì)在針尖附近形成高
速的微小氣泡流，氣泡高速運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力將細(xì)胞破壞  這
并不是一個(gè)瞬時(shí)的過(guò)程，細(xì)胞懸液需要超聲處理數(shù)分鐘以使細(xì)胞裂
解至所需的程度。這種方法并不是初次細(xì)胞破碎時(shí)很好的選擇，但
對(duì)于原生質(zhì)球的破碎和革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜內(nèi)外層的分離而言十分
有效。超聲粉碎機(jī)在使用過(guò)程中通常會(huì)產(chǎn)生熱量，岡此應(yīng)該盡可能
地將樣品置于冰浴中。在微生物裂解中，懸液中按1：2的比例加入
0．1～0．5mm直徑的玻璃珠輔助超聲破碎。超聲過(guò)程中產(chǎn)生的自由
基可以與大多數(shù)生物分子反應(yīng)，可以使用半胱氨酸、二硫蘇糖醇或
其他含有一SH鍵等自由基清除劑，降低這些氧化性的自由基對(duì)樣品
造成的影響。

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