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如何做到快速同時(shí)檢測(cè)各類癌癥當(dāng)中RNA甲基化相關(guān)酶&RNA甲基化水平(下)
點(diǎn)擊次數(shù)：25 發(fā)布日期：2019-3-8
來(lái)源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
上一期文章當(dāng)中，云序通過(guò)引用這樣一張表格給大家傳遞了一個(gè)重要信息：表中的METLL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2均是RNA甲基化重要的酶，而且這些酶在不同疾病當(dāng)中意義有所不同，例如METTL3在AML、BC、HCC當(dāng)中都是原癌基因，而到了GBM當(dāng)中竟然變成了抑癌基因；同樣是甲基化酶，在HCC當(dāng)中，METTL3是原癌基因而METTL14是抑癌基因。不管怎樣這些酶都在疾病當(dāng)中扮演重要角色，對(duì)疾病細(xì)胞的侵襲、增殖能力都有所影響，那么如何做到圍繞一個(gè)酶把故事的來(lái)龍去脈講清楚呢？
RNA甲基化從酶入手，高分文章立刻擁有，截至目前，RNA甲基化相關(guān)領(lǐng)域的研究仍在起步階段，但圍繞甲基化酶研究的思路已經(jīng)是高分文章的首選策略。云序生物課堂，今天就想跟大家聊聊，如何從酶入手打造高分RNA甲基化文章：
1. 確定相應(yīng)疾病背景下的酶
RNA甲基化相關(guān)的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、識(shí)別蛋白三大類，到底選哪一個(gè)酶來(lái)做？良好的開端是成功的一半，哪個(gè)酶最值得研究成了首要問(wèn)題。 RNA-seq檢測(cè)相關(guān)酶的表達(dá)量改變
（DOI: 10.1111/acel.12753）
倍數(shù)表達(dá)變化改變總結(jié)
（DOI: 10.1002/hep.29683）
1）云序生物推薦mRNA測(cè)序結(jié)合qPCR的方式檢測(cè)酶變化
mRNA測(cè)序能給出疾病模型或疾病樣本中異常表達(dá)的所有基因，其中包括RNA甲基化相關(guān)的METTL14、METTL3、FTO和ALKBH5等重要的酶在RNA水平上的變化檢測(cè)。在設(shè)置生物學(xué)重復(fù)的前體下優(yōu)先選擇倍數(shù)表達(dá)變化高的并且p值較小的酶作為潛在的研究靶點(diǎn)。qPCR技術(shù)可以對(duì)選擇的靶點(diǎn)酶進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證用于確定該酶的異常表達(dá)。
相關(guān)酶的WB蛋白檢測(cè)
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
2）蛋白檢測(cè)
不僅局限于RNA水平，云序推薦結(jié)合Western Blot技術(shù)檢測(cè)酶在蛋白水平上的變化，如果在RNA水平和蛋白水平都提供有力的證據(jù)證明酶表達(dá)量改變，則為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
大樣本qPCR驗(yàn)證ALKBH5高表達(dá)與較差臨床預(yù)后有關(guān)
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
3）數(shù)據(jù)挖掘
對(duì)于常見疾病，如癌癥，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)有了相當(dāng)豐富的疾病表達(dá)數(shù)據(jù)以及臨床診斷和預(yù)后相關(guān)分析，友好的網(wǎng)頁(yè)界面方便用戶簡(jiǎn)單點(diǎn)擊鼠標(biāo)就可以快速知道疾病相關(guān)的表達(dá)圖譜，這當(dāng)然一定包含這些酶的信息。漂亮的生存曲線輕松繪制，臨床效果顯著相關(guān)的信息對(duì)于靶點(diǎn)的選擇又是一劑強(qiáng)心劑。
綜上，評(píng)價(jià)一個(gè)酶是否可以作為靶點(diǎn)進(jìn)行研究主要看三方面，RNA表達(dá)改變（變化倍數(shù)和p值）、蛋白表達(dá)改變和臨床意義。
2. 實(shí)驗(yàn)室中復(fù)盤酶的重要生物學(xué)作用
ALKBH5對(duì)細(xì)胞增殖的影響
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
METTL3促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
1）最直接的方式就是對(duì)該酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)并觀察細(xì)胞表型是否有改變
對(duì)于表型的定義針對(duì)不同類型的疾病模型有所區(qū)別，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表型就是我們所熟知的細(xì)胞侵襲、增殖等。另外，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)是證實(shí)甲基化酶調(diào)控細(xì)胞成瘤過(guò)程最直接手段。
整體水平RNA m6A比色法檢測(cè)（Elisa試劑盒）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）整體水平評(píng)價(jià)甲基化水平改變
甲基化酶或者去甲基化酶的過(guò)表達(dá)與敲除理論上會(huì)造成甲基化水平的廣譜改變，此時(shí)可以使用商業(yè)化的比色法試劑盒來(lái)說(shuō)明酶的人工干預(yù)對(duì)甲基化水平產(chǎn)生了影響。
3. 多組學(xué)聯(lián)合運(yùn)用找靶點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序甲基化測(cè)序，雙劍合璧
多個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)取交集找到靶基因
（DOI: 10.1002/hep.29683）
甲基化數(shù)據(jù)同表達(dá)譜數(shù)據(jù)取交集
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）云序生物推薦MeRIP-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)干預(yù)和未干預(yù)的生物學(xué)樣品進(jìn)行m6A甲基化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中會(huì)呈現(xiàn)甲基化位點(diǎn)的具體位置和差異甲基化位點(diǎn)的位置。測(cè)序結(jié)果當(dāng)中會(huì)呈現(xiàn)超甲基化、去甲基化、高表達(dá)、低表達(dá)的相關(guān)基因，而建立這一關(guān)系的理論依據(jù)是甲基化水平的改變會(huì)造成RNA水平的改變。目前RNA甲基化使RNA水平下降是廣泛接受的結(jié)論，影響方式可以通過(guò)降低RNA分子同HuR結(jié)合蛋白的結(jié)合力而使穩(wěn)定性下降，也可以通過(guò)YTHDF家族蛋白識(shí)別并降解RNA的途徑使RNA水平減少。是否有RNA甲基化能促進(jìn)RNA的表達(dá)水平？目前還尚沒(méi)有定論。
4. 靈活展示酶與下游靶基因的關(guān)系以及其他功能實(shí)驗(yàn)
確定了酶和酶潛在靶基因間的關(guān)系。通過(guò)整合多篇高分文章的內(nèi)容，為大家梳理一下思路。
IGV軟件上觀測(cè)到靶基因上存在4處RNA甲基化的區(qū)域
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）驗(yàn)證靶基因的甲基化，mRNA和蛋白表達(dá)情況
任何高通量測(cè)序的結(jié)果都需要通過(guò)低通量的驗(yàn)證，通過(guò)MeRIP-qPCR，qRT-PCR和WB分別驗(yàn)證靶基因的甲基化和表達(dá)量情況。其中，若靶基因mRNA的表達(dá)量不改變，也不用太擔(dān)心，因?yàn)榧谆揎椏赡芨淖兞嗽摶虻牡鞍追g效率，做個(gè)WB試試。
RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALKBH5酶與靶基因直接結(jié)合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶基因能與ALKBH5蛋白直接結(jié)合 （DOI: 10.1002/hep.29683）
2）RNA甲基化酶是否和靶點(diǎn)基因的mRNA直接結(jié)合
通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)，特異性借助RNA 甲基化酶抗體拉取樣本中與其直接結(jié)合的RNA，再通過(guò)qRT-PCR手段，檢測(cè)靶基因是否存在于拉取的復(fù)合物中，從而決定性的證實(shí)甲基化酶與靶基因是直接結(jié)合的。相反的，RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)，借助根據(jù)靶基因合成的探針，特異性拉取與其結(jié)合的蛋白，通過(guò)WB手段，檢測(cè)甲基化酶是否存在于拉取的復(fù)合物中。這樣一來(lái)一往，就能明確兩者是直接結(jié)合的。
3）解釋酶對(duì)甲基化靶基因影響的工作原理 從酶入手研究RNA甲基化策略是這類高分文章的主流，上游的酶，下游的靶基因，建立聯(lián)系一氣呵成，根本上解釋了甲基化酶、去甲基化酶以及識(shí)別蛋白通過(guò)靶基因?qū)膊〉恼{(diào)控作用。云序生物提煉的這一思路適用于大部分疾病的RNA甲基化研究探索，RNA甲基化研究這么熱，這么新，為什么不嘗試用這種方式解釋您關(guān)心的疾病、表型變化中甲基化所起到的作用呢？歡迎廣大老師來(lái)電咨詢?cè)菩蚣夹g(shù)團(tuán)隊(duì)，云序竭誠(chéng)為您服務(wù)。
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RNA甲基化從酶入手，高分文章立刻擁有，截至目前，RNA甲基化相關(guān)領(lǐng)域的研究仍在起步階段，但圍繞甲基化酶研究的思路已經(jīng)是高分文章的首選策略。云序生物課堂，今天就想跟大家聊聊，如何從酶入手打造高分RNA甲基化文章：
1. 確定相應(yīng)疾病背景下的酶
RNA甲基化相關(guān)的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、識(shí)別蛋白三大類，到底選哪一個(gè)酶來(lái)做？良好的開端是成功的一半，哪個(gè)酶最值得研究成了首要問(wèn)題。 RNA-seq檢測(cè)相關(guān)酶的表達(dá)量改變
（DOI: 10.1111/acel.12753）
倍數(shù)表達(dá)變化改變總結(jié)
（DOI: 10.1002/hep.29683）
1）云序生物推薦mRNA測(cè)序結(jié)合qPCR的方式檢測(cè)酶變化
mRNA測(cè)序能給出疾病模型或疾病樣本中異常表達(dá)的所有基因，其中包括RNA甲基化相關(guān)的METTL14、METTL3、FTO和ALKBH5等重要的酶在RNA水平上的變化檢測(cè)。在設(shè)置生物學(xué)重復(fù)的前體下優(yōu)先選擇倍數(shù)表達(dá)變化高的并且p值較小的酶作為潛在的研究靶點(diǎn)。qPCR技術(shù)可以對(duì)選擇的靶點(diǎn)酶進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證用于確定該酶的異常表達(dá)。
相關(guān)酶的WB蛋白檢測(cè)
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
2）蛋白檢測(cè)
不僅局限于RNA水平，云序推薦結(jié)合Western Blot技術(shù)檢測(cè)酶在蛋白水平上的變化，如果在RNA水平和蛋白水平都提供有力的證據(jù)證明酶表達(dá)量改變，則為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
大樣本qPCR驗(yàn)證ALKBH5高表達(dá)與較差臨床預(yù)后有關(guān)
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
3）數(shù)據(jù)挖掘
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（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
METTL3促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
1）最直接的方式就是對(duì)該酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)并觀察細(xì)胞表型是否有改變
對(duì)于表型的定義針對(duì)不同類型的疾病模型有所區(qū)別，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表型就是我們所熟知的細(xì)胞侵襲、增殖等。另外，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)是證實(shí)甲基化酶調(diào)控細(xì)胞成瘤過(guò)程最直接手段。
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（DOI: 10.1002/hep.29683）
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多個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)取交集找到靶基因
（DOI: 10.1002/hep.29683）
甲基化數(shù)據(jù)同表達(dá)譜數(shù)據(jù)取交集
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）云序生物推薦MeRIP-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)干預(yù)和未干預(yù)的生物學(xué)樣品進(jìn)行m6A甲基化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中會(huì)呈現(xiàn)甲基化位點(diǎn)的具體位置和差異甲基化位點(diǎn)的位置。測(cè)序結(jié)果當(dāng)中會(huì)呈現(xiàn)超甲基化、去甲基化、高表達(dá)、低表達(dá)的相關(guān)基因，而建立這一關(guān)系的理論依據(jù)是甲基化水平的改變會(huì)造成RNA水平的改變。目前RNA甲基化使RNA水平下降是廣泛接受的結(jié)論，影響方式可以通過(guò)降低RNA分子同HuR結(jié)合蛋白的結(jié)合力而使穩(wěn)定性下降，也可以通過(guò)YTHDF家族蛋白識(shí)別并降解RNA的途徑使RNA水平減少。是否有RNA甲基化能促進(jìn)RNA的表達(dá)水平？目前還尚沒(méi)有定論。
4. 靈活展示酶與下游靶基因的關(guān)系以及其他功能實(shí)驗(yàn)
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1）驗(yàn)證靶基因的甲基化，mRNA和蛋白表達(dá)情況
任何高通量測(cè)序的結(jié)果都需要通過(guò)低通量的驗(yàn)證，通過(guò)MeRIP-qPCR，qRT-PCR和WB分別驗(yàn)證靶基因的甲基化和表達(dá)量情況。其中，若靶基因mRNA的表達(dá)量不改變，也不用太擔(dān)心，因?yàn)榧谆揎椏赡芨淖兞嗽摶虻牡鞍追g效率，做個(gè)WB試試。
RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALKBH5酶與靶基因直接結(jié)合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶基因能與ALKBH5蛋白直接結(jié)合 （DOI: 10.1002/hep.29683）
2）RNA甲基化酶是否和靶點(diǎn)基因的mRNA直接結(jié)合
通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)，特異性借助RNA 甲基化酶抗體拉取樣本中與其直接結(jié)合的RNA，再通過(guò)qRT-PCR手段，檢測(cè)靶基因是否存在于拉取的復(fù)合物中，從而決定性的證實(shí)甲基化酶與靶基因是直接結(jié)合的。相反的，RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)，借助根據(jù)靶基因合成的探針，特異性拉取與其結(jié)合的蛋白，通過(guò)WB手段，檢測(cè)甲基化酶是否存在于拉取的復(fù)合物中。這樣一來(lái)一往，就能明確兩者是直接結(jié)合的。
3）解釋酶對(duì)甲基化靶基因影響的工作原理 從酶入手研究RNA甲基化策略是這類高分文章的主流，上游的酶，下游的靶基因，建立聯(lián)系一氣呵成，根本上解釋了甲基化酶、去甲基化酶以及識(shí)別蛋白通過(guò)靶基因?qū)膊〉恼{(diào)控作用。云序生物提煉的這一思路適用于大部分疾病的RNA甲基化研究探索，RNA甲基化研究這么熱，這么新，為什么不嘗試用這種方式解釋您關(guān)心的疾病、表型變化中甲基化所起到的作用呢？歡迎廣大老師來(lái)電咨詢?cè)菩蚣夹g(shù)團(tuán)隊(duì)，云序竭誠(chéng)為您服務(wù)。
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