DNA甲基化是哺乳動物基因組中最常見的表觀遺傳事件之一，即DNA中核苷酸與甲基基團的共價修飾[2]。DNA甲基化與人的生命進程有著密不可分的關(guān)系。細胞的增殖與分化、染色體完整性的維護或者X染色體的活性等等都離不開DNA甲基化的控制，DNA甲基化流程在胚胎發(fā)育中是無處不在的[1]。如果DNA甲基化進程出現(xiàn)異常，會導(dǎo)致生物體出現(xiàn)各種各樣的疾病以及身體的生長缺陷或生理紊亂。DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用如果出現(xiàn)異常，會影響基因的表達，從而引起人體內(nèi)腫瘤的發(fā)生或者腫瘤的轉(zhuǎn)移，這一切的源頭都是DNA甲基化進程出現(xiàn)異常的結(jié)果[3]。

DNA甲基化酶是腫瘤治療靶點

DNA甲基化酶是一種修飾酶，經(jīng)常與限制性內(nèi)切酶一同出現(xiàn)。在真核生物基因組以及原核生物基因組中，普遍存在DNA甲基化酶維持以及催化DNA甲基化過程的現(xiàn)象。DNA甲基化酶被廣泛認為是一種治療靶點以及預(yù)測生物甲基化過程的標(biāo)志物，在單細胞水平上準(zhǔn)確靈敏地檢測DNA甲基化酶對于腫瘤醫(yī)學(xué)上的臨床診斷以及臨床治療甚至是生物學(xué)研究有著至關(guān)重要的作用。

根據(jù)甲基化的核苷酸和位置被分為三組，即腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的4-N甲基化和胞嘧啶的5-C甲基化。所有已知的DNA甲基化酶在其甲基化過程中以s-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體。最常見的DNA甲基化不僅發(fā)生在胞嘧啶嘧啶環(huán)5-C位置的CpG位點上，還發(fā)生在對稱四核苷酸5’-G-A-T-C-3’ 中腺嘌呤環(huán)的6-N位置[4,5]。

傳統(tǒng)DNA甲基化酶檢測方法有局限 ?

DNA甲基化酶活性的高靈敏度檢測在基因調(diào)控、表觀遺傳修飾、臨床診斷和治療等方面具有重要意義。

傳統(tǒng)用于檢測DNA甲基化酶活性的方法包括高效液相色譜法(HPLC)[6], 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[7]，凝膠電泳[8]，高效毛細管電泳(HPCE)[9]，以及使用同位素標(biāo)記的s-腺苷甲硫氨酸甲基化檢測[10,11]。盡管這些技術(shù)在實驗室實踐中被證明是有用的，但它們具有局限性。例如，大多數(shù)技術(shù)不僅使用笨重昂貴的設(shè)備，而且需要復(fù)雜的樣品制備和數(shù)據(jù)分析所需的大量時間。同位素標(biāo)記等技術(shù)是有效的，但它們往往需要費力的樣品制備、同位素標(biāo)記、復(fù)雜的設(shè)備和大量的DNA，使得它們不適合在醫(yī)護點使用。

所以，DNA甲基化酶活性檢測迫切需要簡單、便攜、高靈敏度和低成本的檢測方法。在最近的技術(shù)進步中，許多替代的DNA甲基化酶活性測定方法，如放射法、比色法、熒光法、電化學(xué)法等已被提出。此外，其中許多與納米材料或酶結(jié)合，以顯著提高它們的敏感性。

放射法、蛋白質(zhì)納米孔等新型檢測技術(shù)興起 ? ? ? ? ?

放射法：同位素標(biāo)記作為最早檢測DNA甲基化酶活性的方法之一，早期廣泛應(yīng)用于檢測DNA甲基化酶和DNA甲基化的活性[12,13]。在由DNA甲基化酶催化的甲基化過程中，同位素標(biāo)記的甲基部分轉(zhuǎn)移到DNA上，從而賦予甲基化的DNA放射性。這種放射性可以很方便地用閃爍計數(shù)器或放射自顯像儀來檢測?？上У氖?，放射性試劑的介入是限制這種試驗在中央實驗室進行的最大缺點。對無輻射DNA甲基化酶活性檢測的研究導(dǎo)致了甲基化特異性PCR[14]、HPCE[9]和HPLC等替代品的發(fā)展[7,14]，而甲基化特異性PCR被認為是較好的方法。盡管非放射性，上述DNA甲基化酶活性檢測需要龐大且通常昂貴的設(shè)備，冗長且耗時的樣品制備和數(shù)據(jù)分析，以及繁瑣的檢測方案，這在臨床實踐中也比較難以實現(xiàn)全覆蓋。

比色法：比色法用于DNA甲基化酶活性檢測依賴于顏色變化的目視觀察或與DNA甲基化酶相關(guān)的吸收光譜的光譜測量。它們具有成本低、簡單、可移植性和在某些情況下無需儀器的優(yōu)點。雖然紫外-可見光譜法可以量化DNA，但甲基化和未甲基化DNA在紫外-可見吸收特性上的低靈敏度和不顯著差異基本否定了紫外-可見光譜法直接檢測DNA甲基化酶活性[15~17]。

金納米粒子：金納米粒子(AuNPs)由于其表面的等離子體共振吸收的高消光系數(shù)且強依賴于粒子間距離，在DNA甲基化酶活性檢測的比色法研究中引起了廣泛關(guān)注。如圖1 所示，金納米粒子表面包覆有雙鏈DNA (ds-DNA)，其中一條鏈包含DNA甲基化酶識別序列和5’-硫醇末端。在DNA甲基化酶存在的情況下，如圖1 B 所示，DNA甲基化酶被共價標(biāo)記在ds-DNA中堿基環(huán)的6-C位置，因為在5-N位置缺乏一個質(zhì)子阻止了β-消除，甲基化的DNA不能被核酸外切酶 ExoⅠ剪切，因此金納米粒子仍然均勻地分散在溶液中 [18]。從而實現(xiàn)DNA甲基化酶活性的檢測。結(jié)果表明，在526 nm處，金納米粒子聚集物的吸光度與DNA甲基化酶的活性呈2 ~ 32 U / mL的線性關(guān)系，檢出限為0.5 U / mL。

圖1. (A)基于ABP的比色生物傳感器的示意圖

(B) DNA甲基化酶的檢測機制

熒光法：熒光指吸收激發(fā)熒光團的光，以促進電子從基態(tài)到激發(fā)態(tài)，電子迅速地回到激發(fā)態(tài)的最低能級，然后當(dāng)電子最終返回基態(tài)時，發(fā)出波長較長的光。與其他DNA甲基化酶活性測定法相比，熒光法檢測DNA甲基化酶活性的優(yōu)點是檢測過程簡單，靈敏度高，但其復(fù)雜的光學(xué)性能限制了其在集中實驗室的應(yīng)用[19~20]。

圖2. 基于外切酶的靶循環(huán)的DNA甲基化酶活性檢測原理圖

電化學(xué)法：電化學(xué)生物分析技術(shù)的發(fā)展一直是現(xiàn)代分析化學(xué)研究的熱點之一。電化學(xué)法用于DNA甲基化酶分析包括測量電流、電壓、電荷和電阻等電量，以反映DNA甲基化酶的活性。與許多其他類型的DNA甲基化酶活性的檢測相比，它們具有低成本、高靈敏度、執(zhí)行現(xiàn)場監(jiān)測的能力以及非常適合微型化和集成微制造技術(shù)的優(yōu)點[22~23]。

Zhi-Qiang Gao等人在2014年報道了一種簡單、高靈敏度的DNA甲基化酶電化學(xué)活性測定方法。該方法采用電催化氧化抗壞血酸(AA)的信號放大手段，通過一個螺紋插層N,N -2(3-丙基咪唑)-1,4,5,8-萘二酰亞胺(PIND)電催化氧化還原Os(bpy)2Cl+ (PIND-Os)，包含5’-CCGG-3’ 對稱序列的ds-DNA首先固定在金電極上。然后用DNA甲基化酶孵育電極，經(jīng)過酶催化特定CpG二核苷酸的甲基化，然后用識別5’-CCGG-3’ 序列的限制性內(nèi)切酶 Hpa II 剪切酶處理電極，從而實現(xiàn)DNA甲基化酶活性檢測的目的[24]。

圖3. ?DNA甲基化酶活性的檢測原理示意圖

蛋白質(zhì)納米孔：蛋白質(zhì)納米孔檢測技術(shù)是在單分子水平上以低成本、無標(biāo)簽和高通量的方式研究生物分子的檢測技術(shù)。近年來，納米孔技術(shù)正從生物傳感的角度進行研究[25]。應(yīng)用于核酸特征鑒定、化學(xué)反應(yīng)過程的測量、蛋白質(zhì)分析、疾病相關(guān)蛋白狀態(tài)的檢測以及酶動力學(xué)的研究等[26]。α-溶血7素是一種蛋白質(zhì)納米孔，它自發(fā)地插入到脂質(zhì)雙層膜中，形成一個納米孔[27]。當(dāng)一個帶電分子在外加電勢下通過蛋白質(zhì)納米孔時，它會引起離子電流的瞬態(tài)變化，電流變化事件被記錄下來。被分析物可以通過當(dāng)前電流發(fā)生的頻率進行量化，特征電流信號則可以揭示被分析物的各種特征[28~30]。該檢測方法不需要對DNA探針進行任何化學(xué)修飾，既方便又節(jié)約成本，減少了樣品消耗。

圖4. 用于分析DNA甲基化酶活性的納米孔試驗的示意圖

?在過去的十幾年中，DNA甲基化酶活性的檢測取得了重大進展。有幾種方法有希望可在臨床檢測，使得該方法在用于癌癥診斷、預(yù)后和治療方面顯示出了希望。比色法依賴于顏色變化的目視觀察或與DNA甲基化酶相關(guān)的吸收光譜的光譜測量，具有成本低、簡單、可移植性和在某些情況下無需儀器的優(yōu)點，但是檢出限相對較高。熒光法檢測DNA甲基化酶活性的檢測過程簡單，檢出限相對理想，但其復(fù)雜的光學(xué)性能以及昂貴的儀器設(shè)備限制了其在生活中的應(yīng)用。電化學(xué)法由于需要構(gòu)建較復(fù)雜的反應(yīng)電極材料而使得其在臨床上受到了一定的限制。蛋白質(zhì)納米孔的檢測方法不需要對DNA探針進行任何化學(xué)修飾，既方便又節(jié)約成本，減少了樣品消耗，檢出限相對較為理想，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于人類血清樣本。這類檢測可能最終為常規(guī)DNA甲基化酶活性的檢測和分子診斷打開大門，為疾病的管理和診斷帶來新的前景。

作者：王家海、駱 樂

作者簡介：王家海，博士，教授，碩士生導(dǎo)師/博士生導(dǎo)師，廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院；分析化學(xué)專業(yè)；主要研究領(lǐng)域為“基于核算納米結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)載體的納米孔傳感器”；在核酸探針和仿生納米孔兩方面開展了一系列分子識別的工作，也為將來進一步開展分析化學(xué)研究打下了堅實的基礎(chǔ)，期間積累了多種前沿分析方法和技術(shù)：仿生納米孔制備和檢測；微納米加工技術(shù)；核酸探針人工合成技術(shù)。

參 ?考 ?文 ?獻

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