引言

活性氧簇 (Reactive oxygen species， ROS) 是由細(xì)胞內(nèi)正常代謝反應(yīng)，環(huán)境壓力 以及紫外輻射產(chǎn)生的一類物質(zhì)，包括過氧 自由基、羥基自由基、超氧離子和單線態(tài) 氧。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity，ORAC) 分析是一 種用來評估生理液、食品、飲料以及天然 產(chǎn)物抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，它可以定量 檢測樣品清除自由基的能力。通常自由基 能夠與細(xì)胞內(nèi)組分發(fā)生反應(yīng)，破壞正常組 織，引起基因突變，破壞細(xì)胞周期正常運 轉(zhuǎn)，導(dǎo)致癌癥和其他疾病。
這里我們展示的是如何利用 Molecular Devices 熒光微孔板讀板機 Gemini XPS 及SoftMax Pro 軟件聯(lián)合 Cell Biolabs 的 OxiSelect ORAC Assay 來檢測不同果汁 的抗氧化能力，并突出了該方法簡單易行 的特點。

檢測原理

該檢測是基于由偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride，AAPH) 熱解產(chǎn)生的過氧 自由基，在氧自由基吸收物質(zhì)存在的條件 下與熒光素反應(yīng)，從而影響熒光信號強度 這一原理的。氧自由基吸收物質(zhì)的能力越 強，清除的過氧自由基也就越多，熒光信 號持續(xù)的時間也就越長。為了獲得待測樣 品的抗氧化能力，可在熒光強度對時間作 圖的曲線中，計算樣品曲線下方的 區(qū)域面 積，并扣除空白樣品曲線下方的區(qū)域面積 得到結(jié)果。最終結(jié)果以一種維生素E的類 似物 Trolox 的抗氧化能力表示。

材料

Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑 盒，Part No. STA-345
MD 熒光微孔板讀板機 Gemini XPS
Greiner FLUOTRAC 200 全黑微孔板
待測樣品：白蔓越橘汁，白葡萄汁，橙汁， 石榴汁，藍(lán)莓汁，紅酒

方法

以下步驟根據(jù) Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑盒中的操作流程建立。

試劑制備

熒光素探針制備：將試劑盒中所提供的熒光 素探針用所提供的分析稀釋液稀釋 100 倍， 混勻后標(biāo)記為 1×熒光素工作液。
分析稀釋液制備：分析稀釋液按 1:4 的比 列用去離子水稀釋混勻，稀釋后的液體可 為所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋所用，4℃保存。 樣品制備：果汁和紅酒樣品預(yù)先 4℃ 離心 10 分鐘 (5-10,000 x g) 去除顆粒，隨后上 清在分析檢測前稀釋 100 到 1000 倍。

抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所需標(biāo)準(zhǔn)品濃度可通過稀釋 1000 μM 的抗 氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品儲液來獲得，現(xiàn)配現(xiàn)用。濃 度梯度稀釋關(guān)系如表 1 所示，零濃度 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品可作為空白對照。
注：每個標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均需要準(zhǔn)備 2 或 3 個復(fù)孔用于分析。每次分析都需要新鮮配 制標(biāo)準(zhǔn)品。

分析步驟

1. 25  μL 抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入 96 孔板 中，每個樣品 2 個復(fù)孔。
2. 每孔加入 150 μL 1×熒光素工作液，微孔 板充分混勻后放入預(yù)熱的微孔板讀板機中 37℃ 孵育 30 分鐘。
3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中。
4. 加入自由基起始液后立即震板 15 秒以便混 勻液體。微孔板在讀板前需在儀器上震板 5 秒。
5. 利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板 機 Gemini XPS 讀取每孔的動力學(xué)熒光信 號。在 SoftMax Pro 軟件中激發(fā)光波長設(shè)為 485 nm，發(fā)射光波長設(shè)為 520 nm，cuto 設(shè)為 515 nm。微孔板一次整板讀取時間為 1 分鐘，總共持續(xù) 60 分鐘。
注：到分析結(jié)束時，最終熒光信號強度應(yīng)小 于初始熒光強度的 10%，否則應(yīng)提高樣品的 稀釋倍數(shù)重新檢測。

結(jié)果計算

1. 利用 SoftMax Pro 軟件計算每個樣品和標(biāo) 準(zhǔn)品的曲線下方區(qū)域面積 (Area under the curve，AUC)。
2. 每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 應(yīng)當(dāng)通過扣 除空白對照的 AUC 獲得。
3. 以凈 AUC 值為縱軸，Trolox 抗氧化劑標(biāo) 準(zhǔn)品濃度為橫軸作圖。
4. 待測樣品的 Trolox 濃度當(dāng)量 ( TE，單位 μM ) 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得，結(jié)果用 μM TE/mL 表示。

結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析均采用 SoftMax Pro 軟件處理。Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品的動力學(xué)曲線如圖 1 所示。每個標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 通過扣除空白 對照的 AUC 獲得。圖 2 顯示的是每個 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。所有樣品都需要計算凈 AUC。從 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線算出每個樣品的 ORAC 值 以 Trolox 濃度當(dāng)量 ( TE，單位 μM ) 表示，并 乘以各自的稀釋倍數(shù)算出最終 ORAC 值， 單位 μMTE/mL。稀釋 100 倍的樣品的信號 值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，稀釋 1000 倍的樣品 的信號值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，其 ORAC 值如 表 2 所示。待測樣品中紅酒的 ORAC 值最高， 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低。需要注意的 是來自不同制造商生產(chǎn)出的產(chǎn)品的組分可能 不同，會引起樣品 ORAC 值的不同。

總結(jié)

利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板機 Gemini XPS 可以方便地進行 Cell Biolabs 的 OxiSelect ORAC 分析，同時儀器配套 的 SoftMax Pro 軟件可以自動計算結(jié)果并 完成標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。
需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板讀板機如 （SpectraMax M2、 M2e、M3、M4、M5、M5e、Paradigm ） 以及 FilterMax F5 都能夠提供熒光檢測 模式，且都可以進行OxiSelect ORAC 分 析。FlexStation 3 臺式多功能微孔讀板 機還能夠進行自動化加樣。
StakMax 微孔板堆板機可與 SpectraMax Gemini 系列以及 M 系列微孔讀板機整合使 用以提高通量。

References

1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.