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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-03-08  來(lái)源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):905
熒光壽命成像(FLIM)與F rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)相結(jié)合,已被證明非常有利于生物醫(yī)學(xué)研究中各種結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的研究。因?yàn)镕RET信號(hào)強(qiáng)烈依賴于FRET配體和受體的距離,所以FRET允許監(jiān)測(cè)分子相互作用。這允許研究分子的相互作用,如配體-受體復(fù)合物,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、效應(yīng)蛋白與DNA的相互作用等。 另一方面,隨著對(duì)FRET理解的深入,科學(xué)家已經(jīng)可以設(shè)計(jì)FRET探針,以便獲得可控的供體-受體結(jié)合、釋放效率。對(duì)于FRET探針,我們可以分為兩種類型的分子相互作用:探針內(nèi)的FRET供受體和探針與配體的相互作用。 今天小編將詳細(xì)介紹什么是FLIM和FRET,以及FLIM-FRET的結(jié)合帶來(lái)的幾個(gè)應(yīng)用實(shí)例。
目前,大多數(shù)生物探針都是基于熒光。熒光探針亮度的增加或減少取決于其濃度。但是,熒光強(qiáng)度不僅受研究對(duì)象濃度的影響,還受照明強(qiáng)度、光漂白以及基質(zhì)吸收和陰影效應(yīng)等。為了盡量避免這些問(wèn)題,科學(xué)家傾向于優(yōu)先選擇比率染料(ratio-dyes),因?yàn)槠湓试S對(duì)背景的干擾進(jìn)行校準(zhǔn)。盡管如此,基于熒光強(qiáng)度的測(cè)量并不是非常可靠,因?yàn)榧词共捎镁脑O(shè)計(jì)的校準(zhǔn)方法,重復(fù)性也還是不夠理想。 FLIM提供了更好的方法,因?yàn)闊晒鈮勖c染料濃度、照射強(qiáng)度以及熒光信號(hào)在樣品中的吸收和散射無(wú)關(guān),因此對(duì)分子間相互作用不會(huì)產(chǎn)生影響。另一方面,熒光壽命受環(huán)境的影響顯著,這使得FLIM可用于測(cè)量環(huán)境參數(shù)的影響:在一些特殊的分子環(huán)境情況下,存在第二種染料,其可以吸收第一種染料發(fā)射的能量 FRET。該過(guò)程為壽命測(cè)量提供了一種靈敏的方法。對(duì)于這種組合技術(shù),越來(lái)越多的探針被開發(fā)出來(lái),并用于生物醫(yī)學(xué)研究:FLIM-FRET生物傳感器。
什么是FLIM?
熒光的激發(fā)發(fā)生在具有適當(dāng)光子能量(激發(fā)光)的情況下。吸收光子后,分子內(nèi)的原子釋放少量熱量)。因此,與激發(fā)光相比,發(fā)射光具有更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。此外,能量釋放還可以通過(guò)與低能光子的相互作用來(lái)觸發(fā),此種情況被稱為受激發(fā)射,是STED超高分辨顯微鏡的基本原理。最后,能量也可以完全釋放而不發(fā)射光子,從而降低熒光效率。 熒光圖像通常被認(rèn)為是發(fā)射光的二維強(qiáng)度分布??蓽y(cè)量的強(qiáng)度是激發(fā)波長(zhǎng)或發(fā)射波長(zhǎng)或兩者的函數(shù)。通過(guò)對(duì)一系列連續(xù)或不連續(xù)光譜獨(dú)立或同時(shí)檢測(cè)來(lái)測(cè)量發(fā)射信號(hào)。最終結(jié)果用于構(gòu)建彩色圖像、分離信號(hào)通道、分辨空間和時(shí)間中目標(biāo)的相互作用等。然而,熒光過(guò)程也提供了額外的信息維度:與強(qiáng)度無(wú)關(guān)的熒光壽命。熒光壽命可用于在受控條件下識(shí)別和分離熒光物質(zhì),并揭示分子環(huán)境的細(xì)節(jié)。 熒光激發(fā)后,熒光分子會(huì)在激發(fā)態(tài)停留一段時(shí)間,然后衰變回基態(tài)。它們處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間是不可預(yù)測(cè)的,因?yàn)樗橇孔恿W(xué)控制的隨機(jī)過(guò)程。這種過(guò)程的一個(gè)眾所周知的例子是不穩(wěn)定原子核的放射性衰變,而每種核素的半衰期都是非常特殊的。對(duì)于熒光,處于激發(fā)狀態(tài)的時(shí)間 即為熒光壽命。除了強(qiáng)度特征之外,熒光壽命的特殊性使其成為區(qū)分熒光染料的行之有效的方法。 因此,F(xiàn)LIM圖像不代表每個(gè)像素的強(qiáng)度,而是提供像素位點(diǎn)的壽命信息[1]。
經(jīng)典的FLIM測(cè)量方法(時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù),TCSPC)確實(shí)測(cè)量單個(gè)位點(diǎn)的熒光壽命事件。像素信息是 平均到達(dá)時(shí)間 ,即在該像素中測(cè)量的所有壽命事件的平均值,或者是直方圖中對(duì)到達(dá)時(shí)間進(jìn)行曲線擬合提取的一個(gè)或多個(gè)特征時(shí)間。為了獲得顯著結(jié)果,每個(gè)像素應(yīng)該測(cè)量大約400個(gè)TCSPC。因此,我們經(jīng)常聽到的有關(guān)熒光壽命測(cè)量的抱怨: 壽命分析太復(fù)雜了! 。
什么是FRET?
F rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種影響熒光測(cè)量的淬滅現(xiàn)象。上文已經(jīng)介紹,除了發(fā)射光子,分子還可以釋放全部激發(fā)能量而不產(chǎn)生輻射。如果猝滅分子也是熒光染料,則能量可以通過(guò)共振轉(zhuǎn)移到受體(A)從而供體(D)沒(méi)有發(fā)生光子輻射。因此,釋放的能量不會(huì)作為熱量消散,而是存儲(chǔ)在受體熒光染料的激發(fā)態(tài)[2]。對(duì)于FRET的發(fā)生條件,受體的激發(fā)光譜必須與供體的發(fā)射光譜重疊,并且兩個(gè)分子也必須緊密接觸和排列位置適當(dāng)。在這種情況下, 緊密接觸 意味著距離不應(yīng)超過(guò)大約10納米。分子越近,F(xiàn)RET發(fā)生的概率就越高。 FRET模型 距離和轉(zhuǎn)移速率kF之間的關(guān)系: 其中R0表示 F rster半徑 ,它是轉(zhuǎn)移效率為50%的供受體間的距離。F rster半徑假定為每個(gè)供體-受體對(duì)的特定值。供體激發(fā)的特性壽命用 D表示,r為兩種分子之間的實(shí)際距離。由于轉(zhuǎn)移速率與r6成反比,因此FRET僅在供體和受體緊密接觸時(shí)發(fā)生。由于這種關(guān)系是獨(dú)特的,因此,最初FRET僅用于估計(jì)分子距離( 分子標(biāo)尺 )。此外,絕對(duì)的FRET效率還取決于供體發(fā)射和受體激發(fā)的重疊程度以及兩種熒光染料的能量轉(zhuǎn)移方向。 整個(gè)過(guò)程:供體D被短波長(zhǎng)光子Ex激發(fā),能量以非輻射方式(FRET)傳遞給受體A,受體發(fā)射長(zhǎng)波長(zhǎng)光子Em。
下面兩個(gè)現(xiàn)象的發(fā)生可以辨別FRET的發(fā)生。
首先,樣品(受體)發(fā)出的熒光顏色不同于獨(dú)立供體受激發(fā)而發(fā)射的顏色。對(duì)于圖3中的示例,在藍(lán)色激發(fā)之后供體不應(yīng)發(fā)射紅色光。可以測(cè)量該發(fā)射并與供體發(fā)射進(jìn)行比較的方法稱為 sensitized emission 。 Sensitized emission可量化FRET的發(fā)生。這種測(cè)量可以在活體樣本中進(jìn)行,但是如果以熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量則需要復(fù)雜的校正,因此可以用于各種誤差校準(zhǔn)。同樣,壽命測(cè)量也是可選擇的方法。FRET對(duì)壽命的影響將在本文最后一節(jié)中介紹。
其次,供體發(fā)射減少,因?yàn)橐恍┕w激發(fā)將變?yōu)槭荏w激發(fā)。這種現(xiàn)象可以用于 受體光漂白 的測(cè)量,即在通過(guò)光漂白根除受體時(shí)測(cè)量供體發(fā)射的變化。去掉受體后,供體發(fā)射將增加。該方法僅適用于固定樣品。 FLIM-FRET生物傳感器 用生物方法進(jìn)行的標(biāo)記可以統(tǒng)稱為 生物傳感器 ,可以是蛋白質(zhì)或肽、DNA或RNA片段、細(xì)胞等,甚至整個(gè)生物體也可以作為生物傳感器,例如檢測(cè)污染水毒性的死亡率篩選實(shí)驗(yàn)中的淡水魚。在更大概念下,生物傳感器還可以包括含有生物學(xué)部分和光電學(xué)的用于測(cè)量分析物濃度的復(fù)合傳感器。眾所周知的是,例如,葡萄糖生物傳感器 糖尿病患者用于控制血糖的快速且簡(jiǎn)單的裝置。FLIM-FRET生物傳感器通常表示使用熒光(壽命)作為信號(hào)并且發(fā)生FRET的熒光現(xiàn)象。
到目前為止,我們已經(jīng)了解FLIM-FRET生物傳感器的工作原理。
第一部分是探針:通常是與分析物(目標(biāo)分子)相互作用的蛋白質(zhì)或肽。蛋白質(zhì)和肽可以方便地通過(guò)基因工程方法引入到靶標(biāo)內(nèi),因此是優(yōu)選的傳感分子。最著名的例子是鈣調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白可結(jié)合Ca2+離子并在結(jié)合或解除結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化。
第二部分涉及熒光。我們需要用一對(duì)可以進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移的熒光染料標(biāo)記的分子。熒光染料分子必須以一定的方式連接到探針上,即在一種構(gòu)象狀態(tài)下它們相距很遠(yuǎn)并且不能進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移,但在替代構(gòu)象狀態(tài)下它們相距很近、且排列位置適當(dāng),并且觸發(fā)后能進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)探針結(jié)合或釋放被分析物時(shí),F(xiàn)RET會(huì)發(fā)生或消失。我們可以通過(guò)Sensitized emission來(lái)測(cè)量結(jié)合或釋放的程度。如果使用熒光蛋白作為熒光染料,則整個(gè)生物傳感器可以在遺傳上表達(dá),并可以被引入任何生物靶標(biāo)中,甚至是特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。適合的供受體對(duì)如:作為供體的CFP(青色熒光蛋白)和作為受體的YFP(黃色熒光蛋白)。
第三部分是壽命測(cè)量。如上所述,通過(guò)強(qiáng)度進(jìn)行的Sensitized emission測(cè)量容易出現(xiàn)明顯的誤差,并且需要麻煩的校準(zhǔn)和復(fù)雜的校正(主要是因?yàn)閺?qiáng)度受許多其他因素的影響,不僅僅是那些對(duì)FRET過(guò)程有影響的因素)。壽命基本上僅取決于熒光染料種類和所處環(huán)境的影響。在FRET的情況下,與純熒光發(fā)射相比,熒光壽命將會(huì)縮短。在圖4中,使用蓄水池(類似于激發(fā)態(tài)存儲(chǔ)的能量)排水來(lái)解釋壽命縮短的原因。如果供體只能發(fā)出熒光(綠色),那么相當(dāng)于只有一個(gè)排水管控制排空蓄水池的速度(a)。如果供體可以將能量轉(zhuǎn)移到受體,則猶如在蓄水池中打開第二個(gè)排水管(紅色),結(jié)果是水將更快地被排空(b)。 . a):在沒(méi)有FRET的情況下,供體分子的激發(fā)態(tài)能量庫(kù)D 僅通過(guò)發(fā)射光子來(lái)釋放能量。因此,激發(fā)態(tài)的能量?jī)H被一個(gè)控制激發(fā)態(tài)的壽命的漏極(綠色液滴)決定;b):如果受體分子可以從供體分子吸收激發(fā)能量,則存在第二個(gè)排出通道用于排空激發(fā)態(tài)能量庫(kù)。因此,耗盡更快,因此,在發(fā)生FRET的情況下,壽命更短。 這種壽命差異用于檢測(cè)特定分析物(分子內(nèi)FRET)結(jié)合后傳感器分子的構(gòu)象變化。當(dāng)然,可以以相同的方式研究用適合的FRET供受體中兩個(gè)分子之間的任何相互作用。 因此,如果我們測(cè)量供體的壽命變化,就可以監(jiān)測(cè)整個(gè)傳感器的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,并由此監(jiān)測(cè)分析物濃度的變化。如果結(jié)合的構(gòu)象導(dǎo)致較低FRET的發(fā)生,則供體壽命將相對(duì)于分析物濃度增加,反之亦然。 為了以足夠的精度和速度測(cè)量體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的熒光壽命,儀器需要高靈敏度,兼具快速幀頻、以及時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)區(qū)分的適當(dāng)方法[3]。
FLIM-FRET的應(yīng)用示例 為了說(shuō)明FLIM-FRET在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中的作用,小編在此舉下面兩個(gè)例子。 FLIM-FRET應(yīng)用不僅涵蓋用于分析物檢測(cè)的生物傳感器,還涵蓋蛋白質(zhì)、肽、核酸等的各種相互作用。典型地應(yīng)用如熒光蛋白CFP和YFP或衍生物的使用。
一 細(xì)胞Ca2+研究 Ca2+離子在細(xì)胞生理學(xué)中具有許多重要作用,例如,作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的第二信使。它是肌肉收縮的必需成分,能夠釋放神經(jīng)遞質(zhì),并有助于活細(xì)胞的膜電位穩(wěn)定。它也是許多酶反應(yīng)和血液凝固的重要因子。 為了研究這些功能,有必要使用在活細(xì)胞內(nèi)快速且高效代謝的探針。標(biāo)準(zhǔn)FLIM-FRET生物傳感器實(shí)例之一是Ca2+指示劑 cameleon (請(qǐng)參考本文引用文獻(xiàn))。有各種各樣的cameleons,其名稱表示對(duì)Ca2+敏感性及其顏色變化,如chameleon [4]。 Cameleon探針中的傳感器是鈣調(diào)蛋白。它在與鈣結(jié)合后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化。具有兩個(gè)熒光蛋白,例如CFP和YFP,形成FRET-biosensor。 Cameleon鈣傳感器在Ca2+離子結(jié)合時(shí)顯示FRET,即在鈣存在的情況下壽命將縮短。
二 細(xì)胞cAMP研究 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中同樣著名的第二信使是cAMP,它被發(fā)現(xiàn)是盤基網(wǎng)柄菌子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中的形狀調(diào)控因子[5]。cAMP是激素的細(xì)胞內(nèi)信使,不通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移,因此在碳水化合物循環(huán)和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。它還涉及一些離子通道的調(diào)節(jié)。 與cameleon類似,通過(guò)將cAMP結(jié)合蛋白Epac與兩種熒光蛋白融合,可以構(gòu)建生物傳感器[6] [7]。 FLIM-FRET還可用于近些年多種熱門研究中,如非干擾性繪制細(xì)胞球3D培養(yǎng)中代謝狀態(tài)的空間和時(shí)間變化[8],F(xiàn)RET-Biosensor(T2AMPKAR)用于監(jiān)測(cè)腫瘤球體中AMPK(5 腺苷-磷酸激活的蛋白激酶)的活性。為了充分成像球狀體的3D結(jié)構(gòu),可以使用LEICA TCS SP8 DIVE多光子系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)。 這些例子只是生物醫(yī)學(xué)研究中FLIM-FRET應(yīng)用的一小部分。蛋白質(zhì)、供體與受體、DNA與蛋白質(zhì)或DNA片段與RNA的相互作用都可用熒光壽命結(jié)合熒光供振能量轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行研究。因此,F(xiàn)LIM和FRET領(lǐng)域中的研究成果將在不久的將來(lái)顯著增加!
參考
1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)
2.F rster T: Energiewanderung und Fluoreszenz. Die Naturwissenschaften. 6, pp166-175 (1946) 3.Borlinghaus RT: Lifetime - a Proper Alternative. Leica Science Lab (2018)
4.Miyawaki A et al: Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, pp882-887 (1997)
5.Konijn TM et al: The Acrasin Activity of Adenosine-3 -5 -cyclic Phosphate. PNAS 58, pp1152-1154 (1967)
6.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12, pp1176-1180 (2004)
7.Klarenbeek J et al: Fourth-Generation Epac-based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLoS One, 10/4 (2015)
8.Chennell G et al: Imaging of metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM. Sensors (basel), 16/8: 1312 (2016).
 
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