RACE實驗原理
RACE 是采用PCR 技術(shù)由已知的部分cDNA 順序來擴增出完整cDNA5 和3 末端,是一種簡便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。
3 RACE
利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點,以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標準*鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物,用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物,以cDNA*鏈為模板,進行PCR循環(huán),把目的基因3 末端的DNA片段擴增出來。
5 RACE
先利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點,以O(shè)ligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下,反轉(zhuǎn)錄合成標準*鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性,在反轉(zhuǎn)錄達到*鏈的5 末端時自動加上3-5個(dC)殘基,退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后,轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(見Figure 2 )。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物,用一個基因特異引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引物,以SMART*鏈cDNA為模板,進行PCR循環(huán),把目的基因5 末端的cDNA片段擴增出來。最終,從2個有相互重疊序列的3 / 5 -RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA,或者通過分析RACE產(chǎn)物的3 和5 端序列,合成相應引物擴增出全長cDNA。
實驗流程:
1、總RNA提取以及cDNA反轉(zhuǎn)錄
2、根據(jù)已知序列設(shè)計引物,以cDNA模板進行擴增,驗證序列正確性
3、RACE 擴增,并測序,使用錨定PCR(AnchoredPCR)與巢式PCR(Nested PCR)相結(jié)合的方法,分別進行3 末端和5 末端RACE并對其產(chǎn)物進行測序
4、根據(jù)測序結(jié)果拼接目的基因全長cDNA序列
5、將RACE產(chǎn)物進行TA克隆用于后續(xù)研究(可根據(jù)客戶要求自行選擇)
服務優(yōu)勢
采用進口試劑,確保實驗準確性
較同類產(chǎn)品方法更快速,便捷
豐富的項目經(jīng)驗,超過500例的成功案例
提供全套的后續(xù)生物信息學分析服務(可根據(jù)客戶要求提供個性化分析服務)
服務流程
1、確認客戶提供的序列信息
2、評估RACE實驗可行性
3、確認樣本信息
4、根據(jù)客戶提供的信息設(shè)計好實驗方案,銷售做出報價合同
4、客戶確定無誤后簽訂《沃森生物-RACE檢測服務合同》,并簽字(或蓋章)
5、支付預付款,服務正式啟動
6、根據(jù)合同實驗方案開展實驗
8、實驗結(jié)束后,發(fā)送初步實驗報告
9、支付實驗尾款
10、提供詳細實驗報告,完成實驗項目
材料提交說明
實驗樣品
1、組織或者細胞:提供盡可能多的新鮮組織或細胞樣品(包括3個技術(shù)重復),組織樣品不少于200 mg,細胞至少107個
2、RNA樣品:3 RACE:Total RNA 15 g;5 RACE:Total RNA 25 g(注:OD260/OD280在1.9-2.1之間,完整性好)
序列信息:
1、大于200bp的已知序列(請注明已知序列的5 端及3 端):如果已知序列比較短,建議先進行3 RACE再進行5 RACE,以提高實驗的成功率
2、實驗數(shù)據(jù)和參考文獻:這將會幫助我們更好地理解您的實驗背景,有利于實驗的順利進行
結(jié)果交付
實驗結(jié)題報告:包括實驗步驟,引物信息,實驗過程 PCR產(chǎn)物照片,全長序列拼接結(jié)果;
測序原始數(shù)據(jù):測序彩色波形圖、堿基序列圖;
實驗產(chǎn)物:引物、PCR產(chǎn)物、測序用質(zhì)粒(限產(chǎn)生克隆測序的情況)。
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