介紹

急性呼吸道疾病(ARD)在全世界所有急性發(fā)病率和死亡率中占很大比例，其中急性病毒性呼吸道感染是主要原因(約80%)。主要病毒病原體包括流感病毒，呼吸道疾病合胞病毒(RSV)，冠狀病毒，腺病毒和鼻病毒。在5歲以下的兒童中，僅流感和RSV的全球總死亡率每年就達(dá)到300,000例死亡。其他呼吸道病毒(如腺病毒和鼻病毒)的死亡率較低，但發(fā)病率很高，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 可能引起流行病或大流行的高致病性新興和復(fù)發(fā)性冠狀病毒，例如嚴(yán)重的急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，已對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大威脅。最近，一種新穎的冠狀病毒2019-nCoV(https://www.who.int)導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。該冠狀病毒的完整基因組序列已于2020年1月10日發(fā)布，與SARS-CoV和蝙蝠型SARS冠狀病毒(SL-CoV)超過(guò)82%序列相似性。

對(duì)致病性病毒病原進(jìn)行準(zhǔn)確，快速的診斷對(duì)于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǎ炀热藗兊纳?，制止流行病并減少不必要的抗生素使用非常重要。上述所有病毒均可引起上呼吸道感染和下呼吸道感染，以及重疊的臨床表現(xiàn)，如果沒(méi)有扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)室分析，醫(yī)生很難區(qū)分病原體。常規(guī)的診斷方法，例如病毒培養(yǎng)和直接/間接免疫熒光測(cè)定(IFA)，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且靈敏度有限?？焖?，準(zhǔn)確地診斷呼吸道病毒可以幫助進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，以及采取有效的預(yù)防措施和實(shí)施適當(dāng)?shù)目共《局委?。在過(guò)去的幾十年中，從常規(guī)方法到快速抗原檢測(cè)，病毒診斷測(cè)試一直在發(fā)展。最近，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出高靈敏度的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAAT)和即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)。

在這篇綜述中，研究人員描述了目前可用于診斷人類呼吸道病毒感染的各種方法。 預(yù)計(jì)這些數(shù)據(jù)將有助于臨床實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確地診斷呼吸道病毒，從而為醫(yī)生提供及時(shí)和適當(dāng)治療患者的基本信息。該綜述總結(jié)了常用的流感病毒，RSV，冠狀病毒，腺病毒和鼻病毒的診斷方法，并在下面的評(píng)論中進(jìn)行了詳細(xì)描述。

流感病毒及其診斷方法

流感病毒屬于正粘病毒科。 該家族由五個(gè)屬(甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒，Thogotovirus和Isavirus)組成，它們根據(jù)內(nèi)部核蛋白(NP)和基質(zhì)(M)蛋白進(jìn)行分類。 在這些屬中，僅甲型和乙型流感病毒引起臨床疾病。 乙型流感病毒感染通常引起局部性暴發(fā)，而甲型流感病毒是人類感染的主要病原體，因此是大流行性流感的主要原因?；谔堑鞍籽?HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)， 甲型流感病毒位于病毒表面，分為多種亞型。 到目前為止，已鑒定出18種HA(H1-H18)和11種NA(N1-N11)亞型。已使用許多診斷方法，包括病毒分離以及一些新興的基于分子的方法來(lái)檢測(cè)發(fā)生流感的病毒種類。

人類呼吸道合胞病毒及其診斷方法

人RSV是副粘病毒科的無(wú)節(jié)段，負(fù)義和單鏈RNA病毒。RSV的基因組包括十個(gè)編碼11種蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)基因組序列和單克隆抗體(mAb)對(duì)表面糖蛋白(G)和融合蛋白(F)的反應(yīng)性，RSV可以分為A和B組。RSV是導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸道疾病的主要原因。免疫功能低下的人群，例如嬰兒和老年人群，在全球范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和死亡率。早期和準(zhǔn)確的RSV診斷對(duì)于適當(dāng)?shù)闹委熤陵P(guān)重要。

冠狀病毒及其診斷方法

冠狀病毒屬于冠狀病毒科。蝙蝠已被公認(rèn)是各種冠狀病毒的天然宿主和載體，并且該病毒已經(jīng)越過(guò)物種壁壘感染人類和許多其他種類的動(dòng)物，包括鳥(niǎo)類，嚙齒動(dòng)物等。冠狀病毒可能引起呼吸系統(tǒng)疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。到目前為止，已鑒定出六種人類冠狀病毒(HCoV)，包括HCoV-229E，HCoV-HKU1，HCoV-OC43，HCoV-NL63，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒( MERS-CoV)【注：新型冠狀病毒2019-nCoV沒(méi)有統(tǒng)計(jì)在內(nèi)】。

MERS-CoV是一種人類冠狀病毒，于2012年6月首次報(bào)道，可引起人類呼吸系統(tǒng)疾病，它被歸類為C -冠狀病毒譜系，其結(jié)構(gòu)包含約30 kb的正向鏈，人類MERS-CoV與MERS-CoV來(lái)源于駱駝具有超過(guò)99.5%的核苷酸同一性，這表明人和駱駝分離物屬于同一冠狀病毒物種。截至2019年9月30日，實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的2468例MERS-CoV感染病例，包括851例死亡。由于目前尚無(wú)用于MERS的商業(yè)疫苗或治療方法，因此快速準(zhǔn)確地診斷MERS-CoV對(duì)于預(yù)防其傳播和暴發(fā)非常重要。

當(dāng)前對(duì)冠狀病毒的診斷測(cè)試包括RT-PCR，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(rRT-PCR)，逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)以及實(shí)時(shí)RT-LAMP。

基于靶向SARS-CoV和MERS-CoV保守的S2基因的引物和探針，開(kāi)發(fā)了一種RT-PCR方法。通過(guò)使用pUC57SARS-pS2作為SARS-CoV的模板和pGEM-MERSS2作為MERS-CoV的模板，可以實(shí)現(xiàn)50-100拷貝/ mL的足夠檢出限。設(shè)計(jì)了單重RT-iiPCR檢測(cè)MERS-CoV包膜基因(upE)和開(kāi)放閱讀框1a(ORF1a)基因分開(kāi)。與參考單重RT-qPCR檢測(cè)相比，單重MERS-CoV ORF1a和upE RT-iiPCR檢測(cè)的靈敏度分別為99.03%和100%。

有六種基于rRT-PCR的市售MERS-CoV RNA檢測(cè)試劑盒，包括AccuPower(韓國(guó)Bioneer)，Anyplex(韓國(guó)Seegene)，DiaPlexQ(韓國(guó)Solgenent)，LightMix(瑞士羅氏分子診斷公司)，UltraFast試劑盒(韓國(guó)Nanobiosys)和PowerChek(韓國(guó)Kogene Biotech)。 因此，上述六種rRT-PCR試劑盒的整體靈敏度和特異性足以診斷MERS-CoV感染。

在RT-LAMP分析中，構(gòu)建了兩套引物，其中一套針對(duì)N基因，一套針對(duì)ORF1a基因。兩組都顯示了高效擴(kuò)增來(lái)自不同MERS-CoV株的靶序列的效果，并且與其他呼吸道病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)。Huang的研究小組已經(jīng)建立了一種將RT-LAMP技術(shù)和垂直流相結(jié)合的核酸可視化技術(shù)?？梢暬瘲l(RT-LAMP-VF)檢測(cè)MERS-CoV的N基因。RT-LAMP-VF檢測(cè)方法與多個(gè)SARS相關(guān)CoV(包括HKU1，HKU4，OC43和229E)無(wú)交叉反應(yīng)的RNA，因此具有很高的特異性。

上面提到的RT-LAMP和RT-LAMP-VF是用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)MERS-CoV感染的檢測(cè)方法。 Bonhan Kooa的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種拱形多目標(biāo)傳感器，該傳感器能夠通過(guò)在臨床樣品中直接擴(kuò)增來(lái)快速鑒定病原體。該方法能夠以高靈敏度和特異性檢測(cè)包括MERS-CoV在內(nèi)的多種病毒，并且能夠在20分鐘內(nèi)將臨床樣品中的MERS-CoV與HCoV區(qū)分出來(lái)。

   人腺病毒及其診斷方法

腺病毒(AdV)感染現(xiàn)在被視為人類或動(dòng)物發(fā)病率和死亡率的重要來(lái)源。人腺病毒(hAdV)感染很容易傳播，可感染所有年齡段的人群，尤其是嬰兒和老年人，以及具有免疫缺陷和器官移植的人群。HAdV具有直徑70至100nm的無(wú)包膜球形結(jié)構(gòu)。外殼由252個(gè)帽殼組成，包括240個(gè)六鄰體和12個(gè)Penton，由二十面體病毒衣殼組成。帽體排列在20個(gè)三角形表面上，使殼形成30個(gè)邊和12個(gè)頂點(diǎn)。hAdV的基因組以線性雙鏈DNA的形式存在于衣殼中，大小從34到37 kb以上不等。HAdV屬于腺病毒科，已經(jīng)被分類。根據(jù)六鄰體和纖維蛋白特性，相對(duì)核酸同源性，免疫化學(xué)反應(yīng)，生物學(xué)特性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分為7種(A至G)，具有50種以上血清型。該細(xì)分具有一定的臨床意義，主要是因?yàn)椴煌膆AdV在組織方向和疾病類型上有所不同。HAdV可引起多種疾病，例如呼吸系統(tǒng)疾病(hAdV-B，-C和-E)，腸胃炎(hAdV-F和-G)，角膜結(jié)膜炎(hAdV-B和-D)和腦膜腦炎(hAdV-A， -B和-D)。因此，在hAdV進(jìn)展之前對(duì)其進(jìn)行有效，快速的診斷將提供對(duì)hAdV感染的有效監(jiān)測(cè)，并確保及時(shí)有效地治療與hAdV相關(guān)的疾病。

鼻病毒及其診斷方法

鼻病毒(RVs)是屬于Picornaviridae腸病毒科的RNA病毒，已被分類為3種(A至C)，具有超過(guò)160種血清型。RVs是具有二十面體對(duì)稱的小型單鏈RNA病毒。RVs是兒童和成人中最常見(jiàn)的呼吸道感染原因。RV-A和RV-C是常見(jiàn)的RV種類，可引起下呼吸道疾病，喘息和急性哮喘，與兒童相比，它們可能導(dǎo)致比RV-B更嚴(yán)重的癥狀。

病毒的培養(yǎng)分離和酸穩(wěn)定試驗(yàn)相結(jié)合是RV診斷的經(jīng)典方法。但是，該測(cè)定費(fèi)時(shí)且費(fèi)力，從而限制了其在臨床治療中的價(jià)值?？梢酝ㄟ^(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)人RV抗體。但是，由于缺乏合適的交叉反應(yīng)抗原來(lái)覆蓋大量RV血清型，這些方法的應(yīng)用受到很大限制。相比之下，一步式實(shí)時(shí)PCR分析通過(guò)使用序列檢測(cè)RV。該測(cè)定法改善了工作流程，減少了準(zhǔn)備時(shí)間，并消除了從逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟中cDNA可能引入的交叉污染。半嵌套式RT-PCR測(cè)定法基于一種極其靈敏的PCR方法，可檢測(cè)空氣傳播的RVs的檢出限(LOD)約為0.8。隨著全基因組測(cè)序(WGS)技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室可能在臨床上對(duì)人RV分離株進(jìn)行WGS 。隨著hRV-C的發(fā)現(xiàn)，全基因組hRV測(cè)序的數(shù)據(jù)量已大大增加和改善。這將有助于研究人員和臨床醫(yī)生了解RV的進(jìn)化和重組，可以改善診斷。

多重呼吸道病毒檢測(cè)

盡管可以在有癥狀的患者中檢測(cè)到單個(gè)呼吸道病毒，但其他呼吸道病毒也可能同時(shí)存在。兒童，尤其是五歲以下的兒童，發(fā)生共感染的頻率更高。在單個(gè)試管中包含多個(gè)病毒基因靶標(biāo)的多重測(cè)定法具有快速檢測(cè)幾種潛在病毒病原體的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)。多重實(shí)時(shí)PCR已允許在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種呼吸道病毒。與單重方法相比，多重診斷方法具有更高的樣品通量(每次運(yùn)行96個(gè)樣品)，更短的周轉(zhuǎn)時(shí)間(5h)和更少的樣品需求量。

結(jié)論

在全世界所有年齡組中，呼吸道病毒都是癥狀性呼吸道感染的主要原因。對(duì)這些病毒的及時(shí)，準(zhǔn)確的診斷可以對(duì)感染進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委??？偨Y(jié)了幾種常見(jiàn)的呼吸道病毒(如流感病毒，人RSV，冠狀病毒，hAdV和鼻病毒)的傳統(tǒng)和現(xiàn)代分子診斷方法，以及它們的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)和原理。但是，這些呼吸道病毒容易因病毒基因中的點(diǎn)突變而引起抗原漂移，基因重排可能導(dǎo)致具有大流行潛力的新菌株。所有這些繼續(xù)對(duì)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人類呼吸道病毒感染提出了新的挑戰(zhàn)。

因此，鑒定病毒基因組內(nèi)的突變是非常必要的。但是，為查明人類呼吸道病毒的基因突變所做的努力依賴于使用Sanger測(cè)序?qū)蝹€(gè)基因或基因家族進(jìn)行高通量測(cè)序。盡管這種方法取得了豐碩的成果，但Sanger測(cè)序的成本和通量通常禁止構(gòu)成外顯子組的?22,000個(gè)基因的系統(tǒng)測(cè)序。 NGS技術(shù)的最新發(fā)展通過(guò)提供以相對(duì)較低的成本快速測(cè)序外顯子組，轉(zhuǎn)錄組和基因組的能力，改變了這種范例。 NGS在呼吸道病原體的診斷和鑒定中的應(yīng)用，特別是對(duì)于重癥肺炎或不明原因感染的患者，越來(lái)越受歡迎。與傳統(tǒng)方法相比，NGS具有檢測(cè)重癥肺炎患者中合并感染的能力，并且在診斷重癥肺炎中表現(xiàn)良好。作為一種不經(jīng)常循環(huán)的基因型，病毒株整個(gè)基因組的表征將促進(jìn)對(duì)其流行病學(xué)和致病性的進(jìn)一步研究，并有助于診斷新出現(xiàn)的呼吸道病毒。 WGS可以更好地識(shí)別傳播事件和爆發(fā)，這在亞基因組序列中并不總是可能的。